אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:20 דק׳ • July 8th, 2025
קח צלחת מרובת בארות המכילה דילולים סדרתיים של תרכובת הבדיקה, אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד.
הוסיפו תרחיף של Mycobacterium tuberculosis - חיידק פתוגני - לבארות ודגרו.
בציטופלזמה, תרכובת הבדיקה נקשרת לתת-היחידה הריבוזומלית המיקובקטריאלית 30S, מעכבת סינתזת חלבון תקינה ובסופו של דבר מובילה למוות מיקובקטריאלי.
לאחר הדגירה, הוסיפו רזזורין - צבע מסיס במים פלואורסצנטי חלש, לתרביות. דגירה.
בתוך מיקובקטריות פעילות מטבולית בת-קיימא, אנזימי דהידרוגנאז מפחיתים רזזורין בצבע כחול לרסורופינה פלואורסצנטית בצבע ורוד.
בעזרת קורא צלחות פלואורסצנטיות, מדוד את עוצמת הקרינה של רסורופין בבארות.
ערך עוצמת פלואורסצנטי נמוך עם הגדלת ריכוזי תרכובות הבדיקה מרמז על ההשפעות הציטוטוקסיות שלו כנגד המיקובקטריה.
כדי לבצע בדיקת רזזורין, גדל את M. tuberculosis ב-7H9ADST לשלב אמצע העץ. יש לדלל את התרבית עם 7H9ADST ל-OD600 של 0.01. השתמש ב-7H9ADST כדי לדלל את התרכובות פי שניים מריכוזי הבדיקה, ולהוציא 100 מיקרוליטר מכל תרכובת מדוללת לכל באר של צלחת שקופה של 96 בארות.
העבירו 100 מיקרוליטר מתרחיף החיידקים המדולל לכל באר. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה למשך 5 ימים. ממיסים 10 מיליגרם רזזורין ב-100 מיליליטר מים נטולי יונים, ומעקרים את התמיסה בפילטר. הוסף 30 מיקרוליטר תמיסת רזזורין לבארות. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 48 שעות.
צמיחת חיידקים מסומנת על ידי המרת צבע מכחול לוורוד. לבצע ניתוח כמותי על פי פרוטוקול הטקסט.