בדיקת ביופילם של צלחת יתד להקרנת חומרים אנטיבקטריאליים

קח צלחת מיקרוטיטר עם מכסה עם תומכים גליליים, או יתדות, מצופים בביופילמים של חיידקים.

הנח את מכסה היתד המצופה ביופילם על בארות צלחת מיקרוטיטר עם חיץ כדי לחסל חיידקים מחוברים באופן רופף או פלנקטוניים, תוך התמקדות במדידות המחוברות לביופילם.

העבר את מכסה היתד המצופה ביופילם שטוף לצלחת אתגר עם ריכוזי חומרים אנטיבקטריאליים הולכים וגדלים. לדגור בלי לרעוד.

בהתאם לריכוז הסוכן ולפוטנציאל האנטיבקטריאלי, הוא משבש את הפעילות המטבולית של החיידקים ואת שלמות הביופילם.

לאחר הדגירה, הנח את מכסה היתד על בארות צלחת המכילות חיץ כדי להסיר חיידקים פלנקטוניים.

העבירו אותו לבארות צלחת מיקרוטיטר עם מדיום התאוששות ביופילם המכיל רזזורין, צבע פלואורסצנטי חדיר לתאים חלש. דגירה.

בחיידקים פעילים מטבולית, אנזימי דהידרוגנאז מפחיתים רזזורין בצבע כחול לרסורופין פלואורסצנטי בצבע ורוד.

היעדר המרה של רזזורין מעיד על חיסול ביופילם, בעוד שההמרה לרסורופינה מרמזת על נוכחות של תאים ברי קיימא.

ריכוז החומר האנטיבקטריאלי הנמוך ביותר בבדיקה שאינו מניב המרת רזזורין מציין את הריכוז המינימלי של חיסול ביופילם.

קח צלחת טרייה של 96 בארות, והוסף 100 מיקרוליטר CRPMI מאוזן לטמפרטורת החדר לכל באר של שורות B עד H. לדלל עד ארבע תרכובות בדיקה בנפרד ב-1.0 מיליליטר CRPMI עד פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי. הוסף 200 מיקרוליטר של תרכובת אחת בבארות A1 עד A3, 200 מיקרוליטר של תרכובת שתיים בבארות A4 עד A6, 200 מיקרוליטר של תרכובת שלוש בבארות A7 עד A9, ו-200 מיקרוליטר של תרכובת ארבע בבארות A10 עד A12.

לדלל באופן סדרתי את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית. התחל בהעברת 100 מיקרוליטר משורה A לשורה B, וערבב. באופן זה, המשיכו להעביר היטב 100 מיקרוליטר לבאר. מערבבים לאחר כל העברה ועוצרים בשורה F. לאחר הערבוב מוציאים 100 מיקרוליטר משורה F למיכל פסולת. אין להעביר נוזלים לשורות G ו-H. לבסוף, הוסף 100 מיקרוליטר CRPMI לכל באר של הצלחת באמצעות פיפטה רב-ערוצית, כדי להביא את הנפח הסופי ל-200 מיקרוליטר.

הוסף 200 מיקרוליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט לצלחת סטרילית טרייה של 96 בארות הכוללת בארות במידות זהות לאלו של לוחית ההתחלה של הביופילם. לאחר מכן, הסר את שקית הניילון וסרט הפרפין מצלחת התחלת הביופילם המודגרת. הרם את המכסה ישר כלפי מעלה, הימנע ממגע בין היתדות לתחתית הצלחת מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לביופילם. שמור את החלק התחתון לניתוח OD₆₀₀ הבא.

שטפו את תאי הפלנקטון על ידי הנחת מכסה היתד על הצלחת המכילה PBS. טבלו יתדות למשך 5 שניות, הרם אותן מה-PBS וטבל פעם נוספת, היזהר לא לפגוע ביתדות בדפנות הבאר. הנח את מכסה היתד השטוף בצלחת האתגר. הימנע ממגע מיותר בין יתדות לצלחת התחתונה, מכיוון שהדבר יפגע בביופילם ויוביל לתוצאות לא עקביות.

אוטמים את הצלחת בניילון פרפין, ומניחים בשקית ניילון אטומה כמו קודם. דגרו את הצלחת מבלי לנער במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני של 5%. קח את החלק התחתון של לוחית ההתחלה של הביופילם והשהה מחדש את החיידקים בכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מדוד את ה-OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-פלטות מתאים כדי לאשר את הצמיחה המתרחשת בכל הבארות, אך הסטריליות שולטת בשורה H.

השתמש בקורא צלחות המצויד בתא דגירה, ומסוגל לבצע קריאות פלואורסצנטיות קינטיות לזיהוי המרת רזזורין. הגדר מדידת פלואורסצנציה קינטית של 24 שעות באמצעות עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר. הגדר את טמפרטורת החדר ל-37 מעלות צלזיוס וקרא את הצלחת כל 20 דקות.

הגדר את קורא הצלחות למדידה מתחתית הצלחת, בהתאם להוראות היצרן. התכוננו לשטוף את הצלחת על ידי הוספת 200 מיקרוליטר PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות עם פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן, הכינו את מדיום השבת הביופילם על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של 0.8 מיליגרם למיליליטר תמיסת מלאי רזזורין ל-20 מיליליטר של מדיום CRPMI, לריכוז סופי של 16 מיקרוגרם למיליליטר רזזורין.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום התאוששות ביופילם עם פיפטה רב-ערוצית, לכל באר של צלחת טרייה של 96 בארות. העבירו את לוחית האתגר מהחממה לארון בטיחות ביולוגית, והסירו בזהירות את שקית הניילון וסרט האיטום. הסר את מכסה היתד מלוח האתגר ושטוף את תאי הפלנקטון ב-PBS כמו קודם, תוך שמירה על החלק התחתון של לוחית האתגר לניתוח OD₆₀₀ שלאחר מכן.

לאחר השטיפה, הנח את מכסה היתד בתחתית הצלחת המכילה את מדיום השחזור של הביופילם. עטפו את צד הצלחת בסרט פרפין, והקפידו לא לחסום את תחתית הבארות ההיקפיות. מיד לאחר עטיפת הצלחת, הנח אותה על קורא הצלחות והתחל קריאה קינטית במשך תקופה של 24 שעות על ידי התחלת הפרוטוקול הקינטי של רזזורין שנעשה קודם לכן.