בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות חוץ גופית למדידת יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה

קח מיקרו-צלחת המכילה תאי יונקים על קרח.

הוסף מדיום המכיל סידן לבארות נבחרות ומדיום ללא סידן לאחרים.

הציגו מונומרים של רעלן חיידקי היוצר נקבוביות. טמפרטורה נמוכה מונעת הצטברות מונומר, מה שמקל על הקישור לכולסטרול בקרום התא.

דגירה בטמפרטורה פיזיולוגית, מה שמאפשר למונומרים הקשורים לכולסטרול לעשות אוליגומריזציה ולהכניס לתוך הממברנה, וליצור נקבוביות.

בבארות עם סידן חוץ-תאי, הנקבוביות גורמות לזרם סידן.

הזרם מעורר נשירה אקסוזומלית של הרעלן ואיטום מחדש של הממברנה.

עליית הסידן התוך תאית גורמת גם לאקסוציטוזיס ליזוזומלי, ומשחררת אנזים הממיר את הספינגומיאלין של הממברנה לסרמיד.

הממברנה המועשרת בסרמיד מפעילה אנדוציטוזיס רעלן, ואוטמת מחדש את הממברנה.

איטום מחדש של הממברנה מונע בבארות ללא סידן חוץ-תאי.

הוסף פרופידיום יודיד או PI - צבע פלואורסצנטי - שאינו יכול להיכנס לתאים עם ממברנה מתוקנת אך נכנס לתאים פגומים כדי לקשור DNA, ופולט פלואורסצנטיות.

מדוד את הקרינה במרווחים מוגדרים כדי להעריך את יעילות האיטום מחדש של הממברנה.

כדי להגדיר בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות בתפוקה גבוהה לתנאי התיקון המתירניים, שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס M1 בינוני לבאר, והוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום טרי 37 מעלות צלזיוס M1 בתוספת 30 מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד לאחר השלכת הכביסה השנייה.

לתנאים מגבילים לתיקון, שטפו את התאים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של מדיום M2 37 מעלות צלזיוס בתוספת EGTA של 5 מילי-מולרי לבאר, ולאחר מכן שטיפה אחת עם 200 מיקרוליטר של מדיום M2 בלבד.

לאחר השלכת הכביסה השנייה, הוסיפו 100 מיקרוליטר מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס M2 בתוספת 30 מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד לבאר. לאחר מכן, דמיין את הלוח תחת אור מועבר, GFP ו-PI, כפי שהודגם זה עתה. בזמן שהצלחת מצולמת, הנח מיקרו-פלטת פוליפרופילן עגולה עם תחתית עגולה של 96 בארות על קרח, והגדר את הצלחת כפי שהודגם זה עתה עבור הצלחת הקודמת.

לתיקון תנאים מתירניים, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום M1 קר כקרח בתוספת 60 מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד לבאר, ואחריו תוספת של 100 מיקרוליטר M1 קר כקרח עם או בלי 4x ליסטריוליזין O לבאר.

לתיקון תנאים מגבילים, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום M2 קר כקרח בתוספת 60 מיקרו-מולרי פרופידיום יודיד לבאר, ואחריו תוספת של 100 מיקרוליטר M2 קר כקרח עם או בלי 4x ליסטריוליזין O לבאר.

חובה

להכין ליסטריוליזין O בריכוז הניסוי המתאים על קרח כ-5 דקות לפני תחילת הבדיקה הקינטית כאשר לוח 1 נמצא על קרח וצלחת 2 מוכנה.

בסיום ההדמיה של הצלחת הראשונה, העבירו מיד את הצלחת על יריעת נייר אלומיניום על קרח. לאחר 5 דקות, העבירו 100 מיקרוליטר מכל באר של הצלחת השנייה לבאר המתאימה בצלחת המקוררת הראשונה, הכניסו את קצות הפיפטה מתחת למניסקוס התמיסה בכל באר לפני פליטת הנפח מבלי לערבב לפיזור נכון של הרעלן.

אפשר לרעלן להיקשר לתאי המארח למשך דקה אחת, והעביר מיד את הצלחת הראשונה לקורא הלוחות לבדיקה הפוסט-קינטית באמצעות מצב הספקטרופלואורומטר. בתום הבדיקה הקינטית, רכשו מיד הדמיה פוסט-קינטית של תמונת הלוח כפי שהודגם עבור ההדמיה הפרה-קינטית.