מכתים אימונוהיסטוכימיים לזיהוי אנטיגנים של נגיף הכלבת

התחל עם שקופית הנושאת קטע רקמת מוח של עכבר נגוע בנגיף הכלבת המקובע בפורמלין, משובץ בפרפין. החלק הקבוע שומר על אנטיגנים נגיפיים באמצעות קישור צולב של חלבון.

טפל בשקופית בתמיסת קסילן להסרת הפרפין.

טבלו את המגלשה בריכוזי אתנול יורדים כדי להחזיר לחות לרקמה, מה שהופך אותה לתואמת לתמיסות מימיות.

הציגו חוצץ המכיל פרוטאז כדי לשבש קישורים צולבים של חלבונים, ולשפר את הנגישות לאנטיגן.

טבלו במי חמצן כדי לחסום פרוקסידאזות אנדוגניות, ומרחו תמיסת חסימה למניעת אינטראקציות לא ספציפיות.

הכנס נוגדנים ראשוניים ספציפיים לאנטיגן הכלבת, ויוצר קומפלקסים של אנטיגן-נוגדנים.

הוסף נוגדנים משניים ביוטיניליים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים. דגירה עם אנזימי פרוקסידאז מצומדים לסטרפטווידין, המקיימים אינטראקציה עם ביוטין.

הכנס מצע פרוקסידאז, המייצר משקע אדום-מג'נטה.

מכתים את הרקמה בכתם גרעיני, ואחריו חומר מכחלחל, מכתים את הגרעינים בכחול.

התמונה האימונוהיסטוכימית חושפת כתמים אדומים מג'נטה בציטופלזמה, המאשרים את נוכחותם של אנטיגנים לכלבת בקטע הרקמה.

בעזרת מיקרוטום יוצרים קטע פרפין בגודל 5 מיקרומטר. צף את החלק על אמבט מים ב-38 מעלות צלזיוס, ואסוף אותו על מגלשות זכוכית. סמן את השקופיות עם עט עמיד בפני ריאגנטים. מניחים את השקופיות על מגש, וממיסים בתנור בחום של 55 עד 60 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, הוציאו את השקופיות מהתנור, ומיד הסירו אותן באמצעות שלוש שטיפות קסילן רצופות של חמש דקות כל אחת. לאחר מכן, יש להרטיב את החלקים בשקופית על ידי טבילה רציפה בדילול מופחת של אתנול למים נטולי יונים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

טפלו בשקופיות עם הפרוטאז למשך 30 דקות לאחזור אנטיגן פרוטאוליטי, לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBST למשך 10 דקות, וטפלו בהן במי חמצן 3% למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו שוב את השקופיות עם PBST למשך 10 דקות.

כדי להתחיל, הסר שקופית אחת מהמאגר, הקפד לטפל רק בשקופית אחת בכל פעם, בעוד האחרות נשארות שקועות, והשתמש במגבת נייר כדי למחוק את המאגר העודף מסביב לחלק הרקמות. הנח את השקופיות בתא לחות, ודגר עם סרום עיזים רגיל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן, דגרו את המגלשות בתא הלחות עם הדילול האופטימלי שנקבע מראש נוגדנים ראשוניים נגד כלבת ונוגדני בקרה שליליים בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות ללא שטיפות בין לבין. לאחר מכן יש לשטוף את השקופיות עם PBST למשך 10 דקות, ולדגור בתא לחות עם הנוגדן הביוטיניל בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

שוטפים שוב את השקופיות עם PBST למשך 10 דקות. דגרו את המגלשות בתא לחות עם קומפלקס סטרפטווידין-HRP בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ושטפו את ה- PBST למשך 10 דקות. לאחר מכן, דגרו עם AEC בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. שטפו את השקופיות במים נטולי יונים למשך 10 דקות וצביעו עם המטוקסילין של גיל מדולל 1 עד 2 במים נטולי יונים למשך שתי דקות.

לאחר מכן, שטפו את עודפי ההמטוקסילין על ידי טבילת השקופיות במים נטולי יונים. שטפו את המגלשות במי הברז של סקוט למשך 30 שניות, ושטפו במים נטולי יונים למשך 10 דקות. הסר את השקופיות אחת אחת והרכיב אותן עם מדיום הרכבה מסיס במים. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לקרוא את השקופיות.