שיטת Crosslinking Immunoprecipitation משופרת לזיהוי יעיל של RNA הקשור לחלבון באשכי עכברים
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:07 דק׳ • July 8th, 2025
קח אשך עכבר טרי שנקטף במאגר צונן. הסר את הטוניקה אלבוגינאה, שכבת הרקמה הסיבית.
יש לשלש את האשך כדי לשחרר צינורות זרע המכילים תאי נבט וסרטולי.
הוסף חיץ וחשוף את הצינורות לקרינת UV לקישור צולב בלתי הפיך של RNA עם חלבונים קשורים, תוך שמירה על אינטראקציות.
צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש את הצינורות במאגר ליזה המכיל מעכבי RNase ופרוטאז.
סוניקציה של הרקמה, שחרור קומפלקסים של חלבון-RNA ורכיבים תוך-תאיים אחרים. מעכבי ה-RNase והפרוטאז מנטרלים RNases ופרוטאזות אנדוגניות.
הוסף DNase כדי לפגוע ב-DNA. הציגו RNase מדולל לעיכול RNA חלקי.
צנטריפוגה ולהעביר את הסופרנטנט המכיל קומפלקסים של חלבון RNA לתמיסת חרוז מגנטי מצופה נוגדנים עם ספציפיות גבוהה לחלבון קושר ה-RNA המטרה.
הפעל שדה מגנטי כדי להפריד את קומפלקסי החלבון-RNA הקשורים לחרוזים. השליכו את הסופרנטנט.
לשטוף עם חיץ. הפרד מגנטית את קומפלקסי החלבון-RNA והשתמש בהם לניתוח אינטראקציה נוסף של RNA-חלבון.
כדי להתחיל בהליך זה, קצרו כ-100 מיליגרם אשכים מעכברים בגיל המתאים לכל ניסוי חיסוני. מניחים את הטישו ב-PBS קר כקרח. בעזרת זוג פינצטה עם קצה עדין, הסר בעדינות את הטוניקה אלבוגינאה. הוסף 3 מיליליטר PBS קר כקרח למטחנת טישו, והשתמש בעלי זכוכית רופף כדי לשבש את הרקמה בכוח מכני עדין. לאחר מכן, העבירו את תרחיף הרקמה לתבנית תרבית תאים, והוסיפו PBS
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים