אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 6:20 דק׳ • July 8th, 2025
קח תאי איברי לימפה משניים מעכבר מחוסן אנטיגן, המכיל תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בשלבים שונים של מחזור התא.
G1, S, G2 ו-M הם שלבים של חלוקה פעילה של תאים, בעוד שתאים בשלב G0 שקטים.
הוסף צבע כדאיות פלואורסצנטי לסימון תאים מתים, ונוגדנים מתויגים פלואורופור הנקשרים לסמני פני השטח של תאי T CD3 ו-CD8.
הציגו מולטימרים של פפטיד-MHC אנטיגניים מצומדים פלואורופור כדי לקשור קולטנים של תאי T, ולסמן את תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן.
בעזרת מאגר, תקן וחלחל את התאים.
הציגו נוגדנים מתויגים פלואורופור כדי לקשור חלבון גרעיני הקשור להפצת תאים - לצבוע את התאים המתחלקים באופן פעיל.
הוסף כתם פלואורסצנטי לתווית DNA.
באמצעות ציטומטריית זרימה, בחר את התאים החיים וזהה את תאי CD8+ T הספציפיים לאנטיגן באמצעות התוויות הקשורות לפני השטח.
עוצמת כתם ה-DNA מבחינה בין תאי G0 ו-G1 עם כמות DNA נמוכה יותר מתאי S, G2 ו-M עם כמות DNA גבוהה יותר. היעדר הנוגדן הספציפי לחלבון הגרעיני מפריד בין תאי G0.
הכן מאגר כביסה טרי של 1X על ידי דילול מאגר חדירות פי 10 במים מזוקקים, וסנן אותו דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי לחסל אגרגטים. דילול נוגדן חד שבטי Ki67-FITC במאגר שטיפת חדירות 1X כפי שנקבע בניסוי טיטרציה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לדגימה.
הוסף 3 מיליליטר של מאגר שטיפת החדירות 1X לכל צינור עם תאים וצנטריפוגה ב-400 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט. שוב, הוסף את מאגר שטיפת החדירות 1X ואת הצנטריפוגה כדי לגלול את התאים, ולאחר מכן, השליך את הסופרנטנט.
הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן חד שבטי מדולל Ki67-FITC לגלולה, ולאחר מכן, מערבול ודוגר למשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של מאגר חדירות 1X, צנטריפוגה לאחר כל שטיפה, ולהשליך את הסופרנטנט.
הוסף 350 מיקרוליטר PBS לגלולת התא לדגימות שיירכשו ישירות בציטומטר הזרימה, ו-250 מיקרוליטר PBS לכדור התא לדגימות שידגרו עם Hoechst לצביעה DNA. הכינו תמיסת Hoechst ו- PBS והוסיפו אותה לכל דגימה, כך שהריכוז הסופי יהיה 2 מיקרוגרם למיליליטר. מערבולת ודוגרים על הדגימות למשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות למשך 5 דקות והוסף 350 מיקרוליטר PBS לכדור התא.
פתח את התוכנה וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על ידי לחיצה על צור קבוצה בקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה. פתח את חלון שינוי קבוצה על ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה וסנכרן את הקבוצות החדשות שנוצרו על ידי הוספת סימן ביקורת על הפונקציה מסונכרן.
גרור כל קובץ FCS לקבוצה המתאימה לו, ולאחר מכן, צור אסטרטגיית שער המתחילה בקבוצת LN דרך. פתח את חלון הגרף על ידי לחיצה כפולה על הדגימה המוכתמת במלואה כדי להציג את האירועים הלא מוכשרים שנרכשו עבור דגימה זו בתרשים נקודות. שים לב שציר ה-x וציר ה-y מסומנים כמו בקבצי FCS, כפי שמצוין בטבלה 2 של קובץ הגדרות ציטומטר הזרימה של כתב יד זה. בדוק שמוצג מספר מספיק של אירועים לצורך הדמיה מתאימה.
במידת הצורך, פתח את העדפות על ידי לחיצה על סמל הלב ברצועת הכלים של סביבת העבודה, בחר גרפים, לאחר מכן התווה נקודה כסוג גרף, ובדוק שמספר הנקודות המצוירות בתיבה המתאימה נכון או שנה אותו. הציגו את האירועים הלא מחוברים בחלון הגרף בתרשים נקודות עם DNA-A על ציר ה-x ו-DNA-W על ציר ה-y. השתמש בקנה מידה ליניארי עבור שני הצירים. במידת הצורך, שנה את קנה המידה מלוגריתמי לליניארי על ידי לחיצה על התיבה המצוינת ב- T קרוב לכל ציר בחלון הגרף.
בחר אוכלוסיית תאים בודדת על ידי לחיצה על מלבן בקטע כלי שער, ולאחר מכן לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בתרשים נקודות עם פרמטר FSC-A על ציר ה-x וצבע תאים מתים על ציר ה-y.
לחץ על המצולע כדי לבחור את אוכלוסיית התאים החיים, שהם שליליים לצבע תאים מתים. לחץ פעמיים במרכז שער המצולע כדי להציג את התאים בתרשים נקודות עם הפרמטר FSC-A על ציר ה-x והפרמטר SSC-A על ציר ה-y.
לחץ על מלבן וצור שער "רגוע" כדי לכלול את כל התאים החיים הבודדים בגרף זה. לחץ פעמיים במרכז השער הרגוע כדי להציג את התאים בתרשים נקודות עם CD3 על ציר ה- x ו- CD8 על ציר ה- y.
השתמש בקנה המידה המתאים של הציר לתצוגה חזותית בחלון הגרף. במידת הצורך, שנה את קנה המידה x ו-y על ידי לחיצה על התיבה המצוינת ב-T קרוב לכל ציר. בחר התאמה אישית של פונקציית ציר ושנה עשורים שליליים נוספים, בסיס רוחב ועשורים חיוביים לפי הצורך.
בחר את התאים החיוביים ל-CD3, חיוביים ל-CD8 על ידי לחיצה על Polygon. לחץ פעמיים במרכז השער החיובי ל- CD3 וחיובי ל- CD8 כדי להציג את התאים בתרשים נקודות עם Tetr-gag על ציר ה- x ו- Pent-gag על ציר ה- y. בחר את תאי CD8 T הספציפיים לאנטיגן על ידי לחיצה על מצולע. לחץ פעמיים במרכז השער הספציפי לגאג כדי להציג את התאים בתרשים נקודות עם DNA-A על ציר ה-x ו-Ki67 על ציר ה-y. בחר את התאים בשלבי מחזור התאים השונים על ידי לחיצה על Quad בקטע כלי שער של חלון הגרף.