שימוש בבדיקות מתח מבוססות DNA כדי להעריך את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון

התחל עם כיסוי זכוכית פונקציונלית עם ננו-חלקיקי זהב מעוגנים בפוליאתילן גליקול.

הוסף בדיקות מתח סיכת ראש DNA המכילות סיכת ראש DNA הכלאה עם שני אוליגונוקלאוטידים בזרועות מנוגדות.

גדיל הליגנד כולל פלואורופור וביוטין, בעוד שגדיל העוגן מכיל מרווה וקבוצת תיול. במערך זה, המרווה מדכא את הקרינה.

בדיקות ה-DNA נקשרות לננו-חלקיקי הזהב, ומעוגנות לכיסוי הזכוכית.

הכניסו סטרפטווידין, באינטראקציה עם מולקולות הביוטין של גדילי הליגנד.

הוסף ליגנדים ביוטיניים הנקשרים למולקולות סטרפטווידין קשורות מראש.

כיסו את הכיסוי עם תאי T חיוביים ל-CD8; הקולטנים שלהם מקיימים אינטראקציה עם ליגנדים משותקים, ויוצרים אתר אינטראקציה בין קולטן-ליגנד.

אינטראקציה זו יוצרת כוח הפותח את מבנה סיכת הראש של ה-DNA, מפריד את הפלואורופור מהמרווה ומקדם פליטת פלואורסצנטיות.

הציגו גדילי נעילה שאינם פלואורסצנטיים המקיימים אינטראקציה עם מקטעים פרושים של הבדיקות כדי לשמר את אות הקרינה.

כמת את הקרינה כדי להעריך את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי החיסון.

כדי להתחיל, הניחו כיסויים של 25 מילימטר על מתלה פוליטטרפלואורואתילן בכוס של 50 מיליליטר, ושטפו את הכיסויים שלוש פעמים על ידי טבילתם במים. מערבבים כמויות שוות של אתנול ומים, ומוסיפים 40 מיליליטר מתמיסה זו לכוס המכילה את המתלה ואת הכיסויים. לאחר מכן, אטמו את הכוס באמצעות סרט פרפילם.

נקה את הכיסויים על ידי סוניזציה של הכוס למשך 15 דקות בחומר ניקוי קולי, והשליך את הנוזל לאחר סוניקציה. לאחר מכן, שטפו את הכוס המכילה את המתלה והכיסויים במים, לפחות שש פעמים כדי להסיר את כל הממס האורגני שנותר. להכנת תמיסת פיראנה טרייה, הוסיפו 30 מיליליטר חומצה גופרתית לכוס של 50 מיליליטר והוסיפו לאט לאט 10 מיליליטר מי חמצן. מערבבים בעדינות את תמיסת הפיראנה בעזרת קצה פיפטה מזכוכית.

כדי ליזום תחריט, העבירו את המתלה המחזיק את הכיסויים לכוס המכילה תמיסת פיראנה, ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנקות ולהידרוקסיליזציה של הכיסויים. לאחר מכן, העבירו את המתלה באמצעות פינצטה מפלדה או פוליטטרפלואורואתילן לכוס נקייה של 50 מיליליטר ושטפו במים שש פעמים. על מנת להסיר מים לחלוטין, טבלו את המתלה המחזיק את הכיסויים בכוס של 50 מיליליטר עם 40 מיליליטר אתנול, ואז השליכו את האתנול.

לאחר מכן, טבלו את המתלה ב -40 מיליליטר אתנול המכיל 3% אמינופרופיל טריאתוקסי סילאן למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי להתחיל את התגובה עם קבוצת ההידרוקסיל על הכיסויים. שוטפים את פני הכיסויהחלקה שש פעמים על ידי טבילתם ב -40 מיליליטר אתנול, ומייבשים אותם בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

מכסים את החלק התחתון הפנימי של צלחת הפטרי בנייר דבק כדי למנוע מהכיסויים להחליק בתוך צלחת הפטרי. לאחר מכן, הנח את הכיסויים המכוסים באמין כשהצד לתפקוד עם בדיקות מתח DNA כלפי מעלה. מכסים את הכיסויים במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

כדי לשנות את קבוצות האמין על תלושי הכיסוי, הוסף חומצה ליפואית-PEG-NHS ו- mPEG-NHS ודגירה על צלחת הפטרי בטמפרטורת החדר למשך שעה. בתום הדגירה יש לשטוף את המשטח שלוש פעמים במים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של 0.1 נתרן ביקרבונט מולארי המכיל 1 מיליגרם למיליליטר של סולפו-NHS-אצטט לקבוצה של כיסויי כריך, ודגירה למשך 30 דקות כדי להתרחש פסיבציה.

הוסף 0.5 מיליליטר ננו-חלקיקי זהב לכל כיסוי ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשטוף את הכיסויים במים שלוש פעמים. לאחר הוספת גדיל מרווה חור שחור 2 לבדיקת מתח ה-DNA המחוסמת ביחס של 10 ל-1, הוסף 100 מיקרוליטר מהתערובת לכל שני כיסויים להכנת הכריך.

הניחו בזהירות כדור טישו מעבדה רטוב בצלחת הפטרי הרחק מהכיסויים, ואטמו את הכלי עם סרט פרפילם כדי למנוע את התייבשות התמיסה. לאחר מכן, מכסים את התבשיל בנייר כסף, ומדגרים אותו בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הרכיבו את תא ההדמיה תוך הקפדה על מניעת סדקים במשטח תוך הידוק החדר. לאחר מכן, הוסף 0.5 עד 1 מיליליטר מתמיסת המלח המאוזנת של האנק לתא ההדמיה.

השתמש בערוץ Cy3B עם מטרה של פי 100 כדי ללכוד אותות פלואורסצנטיים של תאים המצופים על בדיקות המתח של סיכת הראש של ה-DNA כאשר הם מתחילים להתפשט. לאחר הכנת 100 גדילי נעילה מיקרו-מולאריים שאינם פלואורסצנטיים, בנקודת הזמן הרצויה, הוסיפו אותו לתאים בריכוז סופי של 1 מיקרומולר בתא ההדמיה כדי לאחסן את אות המתח, וערבבו אותו עם התאים על ידי פיפטינג.

לאחר כ-10 דקות של נעילה, רכוש סרטי זמן-lapse או תמונות נקודת קצה באפיפלואורסצנציה הן למיפוי מתח איכותי והן לניתוח כמותי.