בדיקה סלולרית לזיהוי סוכנים בעלי אינטראקציה CXCR4
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:52 דק׳ • July 8th, 2025
קח צלחת מרובת בארות מצופה ג'לטין המכילה תאי סרטן מוח אנושיים דבוקים המבטאים CXCR4.
החלף את המדיה בצבע רגיש לסידן. אסטרזות תוך-תאיות מבקעות את הצבע למוצר אטום לממברנה הנקשר ליוני סידן, ומציג פלואורסצנטיות מוגברת.
הסר את הצבע, שטוף והוסף חיץ.
הנח את הצלחת בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי עם תרכובת אינטראקציה CXCR4 וצלחות המכילות כימוקין CXCL12.
באמצעות פרמטרים אוטומטיים מוגדרים, הזריקו ריכוזי תרכובות הולכים וגדלים לבארות בדיקה, ואחריהם ריכוז CXCL12 ספציפי.
בבארות בקרה ללא התרכובת, CXCL12 נקשר ל-CXCR4.
קשירה זו מפעילה מפל איתות, ומשחררת יוני סידן לתוך הציטופלזמה, שם הם קושרים את הצבע, ומגבירים את הקרינה.
עם זאת, בבארות בדיקה, תרכובות אינטראקטיביות מעכבות את קשירת CXCL12 ל-CXCR4, משפיעות על גיוס הסידן וגורמות לירידה פלואורסצנטית תלוית מינון, מה שמאשר אותם כאנטגוניסטים של CXCR4.
ביום מעבר התאים, מצפים כל באר של צלחת פוליסטירן שחורה עם 96 בארות עם תחתית שקופה עם 100 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין 0.1%, ודוגרים על הצלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בזמן שהג'לטין מתמצק, השתמש בתמיסת טריפסין-EDTA כדי להרים את התאים המעניינים מתחתית בקבוק התרבית שלהם, ולהשעות מחדש את התאים במצע גידול טרי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר לאחר ניתוקם.
לאחר הספירה, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעו את הגלולה במדיום גידו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים