בדיקה סלולרית לזיהוי סוכנים בעלי אינטראקציה CXCR4

קח צלחת מרובת בארות מצופה ג'לטין המכילה תאי סרטן מוח אנושיים דבוקים המבטאים CXCR4.

החלף את המדיה בצבע רגיש לסידן. אסטרזות תוך-תאיות מבקעות את הצבע למוצר אטום לממברנה הנקשר ליוני סידן, ומציג פלואורסצנטיות מוגברת.

הסר את הצבע, שטוף והוסף חיץ.

הנח את הצלחת בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי עם תרכובת אינטראקציה CXCR4 וצלחות המכילות כימוקין CXCL12.

באמצעות פרמטרים אוטומטיים מוגדרים, הזריקו ריכוזי תרכובות הולכים וגדלים לבארות בדיקה, ואחריהם ריכוז CXCL12 ספציפי.

בבארות בקרה ללא התרכובת, CXCL12 נקשר ל-CXCR4.

קשירה זו מפעילה מפל איתות, ומשחררת יוני סידן לתוך הציטופלזמה, שם הם קושרים את הצבע, ומגבירים את הקרינה.

עם זאת, בבארות בדיקה, תרכובות אינטראקטיביות מעכבות את קשירת CXCL12 ל-CXCR4, משפיעות על גיוס הסידן וגורמות לירידה פלואורסצנטית תלוית מינון, מה שמאשר אותם כאנטגוניסטים של CXCR4.

ביום מעבר התאים, מצפים כל באר של צלחת פוליסטירן שחורה עם 96 בארות עם תחתית שקופה עם 100 מיקרוליטר של תמיסת ג'לטין 0.1%, ודוגרים על הצלחות למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בזמן שהג'לטין מתמצק, השתמש בתמיסת טריפסין-EDTA כדי להרים את התאים המעניינים מתחתית בקבוק התרבית שלהם, ולהשעות מחדש את התאים במצע גידול טרי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר לאחר ניתוקם.

לאחר הספירה, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעו את הגלולה במדיום גידול טרי לריכוז של 1 x 10⁵ תאים ברי קיימא למיליליטר. כשהצלחות מוכנות, השליכו את כל תמיסת הג'לטין העודפת וייבשו את הצלחות על רקמת מעבדה. לאחר מכן, שטפו את הבארות ב-200 מיקרוליטר PBS, והחליפו את הכביסה ב-200 מיקרוליטר תאים לבאר, לדגירה לילית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

למחרת בבוקר, הקש על הצלחת כדי להשליך את מצע הגידול מהבארות, וייבש את הצלחת הפוכה על מגבת נייר. לאחר מכן, סמנו את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת צבע טעינה לבאר, ודגרו על הצלחת למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בזמן שהתאים דוגרים, הוסיפו 75 מיקרוליטר של CXCL12 לכל באר לצלחת הכימוקין, ו-50 מיקרוליטר מהתרכובת המעניינת לכל באר של צלחת התרכובת.

לאחר מכן, הפעל את היחידה הקרירה יותר של קורא לוחות הקרינה, ואחריו את קורא הצלחות עצמו. לאחר שאפשרת למערכת מספר דקות לפעול, פתח את תוכנת קורא הלוחות. כדי להגדיר את פרוטוקול הבדיקה, תחת הכרטיסייה הגדרות, בחר מצב קריאה, ואת אורך גל העירור והפליטה המתאים עבור צבע הטעינה.

בחר בכרטיסייה "ערבוב עם נוזל העברה" לערבוב אוטומטי של התרכובות בצלחת התרכובת. בכרטיסייה "נוזל העברה", הגדר 20 מיקרוליטר מכל באר מלוח התרכובת שיועבר ללוחית המדידה, ומקם את קצות הפיפטה ב-20 מיקרוליטר מתחת לפני הנוזל. הגדר את מהירות השאיפה ל-50 מיקרוליטר לשנייה, ואת מהירות החלוקה ל-25 מיקרוליטר לשנייה ולחץ על "קרא עם נוזל העברה".

במהלך המרווח הראשון, בחר 60 קריאות עם זמן מרווח קריאה של שנייה אחת עם 10 קריאות לרישום לפני חלוקת התרכובות ללוחית המדידה, ו-50 קריאות שיושלמו לאחר מכן. הגדר את המרווח השני עם זמן מרווח הקריאה של 30 שניות ו-18 קריאות. בחר שלוש שטיפות קצה לפרוטוקול, הגדר כל שלב כביסה כך שיכלול את נוזל הכביסה המתאים, מחזור כביסה אחד, מהירות משאבה מהירה וחמש פעימות לכל כביסה.

השתמש בפונקציה "השהה פיפטור" כדי לכלול הפסקת פיפטור של 300 שניות והשתמש בהגדרה "ערבוב עם נוזל העברה" כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של תמיסת CXCL12 בתוך לוחית הכימוקין. בכרטיסייה "נוזל העברה" שלאחר מכן, הגדר 25 מיקרוליטר מכל באר של לוחית הכימוקין להעברה ללוחית המדידה ומקם את הקצוות 20 מיקרוליטר מתחת לפני הנוזל. הגדר את מהירות השאיפה ל-50 מיקרוליטר לשנייה, ואת מהירות החלוקה ל-25 מיקרוליטר לשנייה.

השתמש בלחצן "קרא עם נוזל העברה" כדי להגדיר את המרווח הראשון כך שיכלול 145 קריאות עם זמן מרווח קריאה של שנייה אחת. הגדר את מרווח הזמן השני לזמן מרווח קריאה של שש שניות ו-20 קריאות. בחר שלושה מחזורי קצה כביסה נוספים, ולאחר מכן לחץ על "הגדר tagטמפרטורה" והגדר את טמפרטורת המכשיר ל-37 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה של צבע הטעינה, השליכו את המאגר מלוח המדידה וייבשו את הצלחת על רקמת מעבדה. שטפו את התאים עם 150 מיקרוליטר לכל באר של מאגר בדיקה, והחליפו את המאגר ב-80 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לאחר שתי דקות. הנח את לוחית המדידה במצב קריאה, את לוחית המורכבת במצב מקור 2, את לוחית הכימוקין במצב מקור 3 וקופסת טיפים שחורים במצב מקור 1.

סגור את המכשיר ולחץ על "בדיקת אות פרוטוקול" כדי לקבוע את יחידות האור היחסיות ברקע וגרסאות הקרינה מעל הצלחת. בחר בדוק "אות" בחלון המוקפץ. אם מתקבלים ערכי רקע של 8,000 עד 10,000 יחידות אור יחסיות, בחר "עדכן" ולחץ על "שמור" כדי לשמור את הפרוטוקול הראשי.