מדידה חוץ גופית של פעילות האנזים α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז

α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז הם אנזימים ליזוזומליים החיוניים לחילוף החומרים התאי.

α-גלקטוזידאז A מפרק מצעים כגון גליקוליפידים, בעוד שחומצה α-גלוקוזידאז מפרקת גליקוגן.

כדי למדוד את פעילות האנזים שלהם במבחנה, קח בארות מרובות בארות עם דגימות המכילות ריכוזים ידועים של α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז, בהתאמה.

הוסף לבארות את הנפח הנדרש של תמיסות חומציות של מצעי 4-Methylumbelliferyl סינתטיים, מצעים פלואורוגניים ספציפיים שנועדו לחקות מצעים טבעיים לאנזימים אלה.

דגירה בחושך.

α-גלקטוזידאז A ואנזימי חומצה α-גלוקוזידאז מבקעים את המצעים שלהם, ומשחררים את התוצר הפלואורסצנטי, 4-methylumbelliferone.

הוסף מאגר אלקליין כדי לסיים את התגובה האנזימטית.

בעזרת קורא פלואורסצנטי מיקרו-פלטה, מדוד את עוצמת הקרינה של 4-methylumbelliferone בבארות, המעידה על ריכוזו, כדי לקבוע את פעילות האנזים α-galactosidase A ו-acid α-glucosidase, בהתאמה.

לדלל את הכמות המחושבת של כל דגימה ולהכניס אותה לצינורות תגובה טריים של 1.5 מיליליטר כדי לקבל 0.05 מיקרוגרם של אלפא-גלקטוזידאז A או 0.5 מיקרוגרם של חומצה אלפא-גלוקוזידאז למיקרוליטר תמיסה. מערבל שוב את הדגימות למשך 5 שניות, ופיפטה 10 מיקרוליטר מהדילול הזה ומשכפל לצלחת של 96 בארות.

התחל את התגובות על ידי הוספת 20 מיקרוליטר מתמיסת המצע המתאימה. עבור אלפא-גלקטוזידאז A, הוס