בדיקה להערכת ההשפעה של תרכובות בדיקה על כניסה נגיפית ואיחוי בתאים מארחים

קח תאי סרטן כבד, ודגירה בטמפרטורה נמוכה כדי לפגוע באנדוציטוזיס.

הציגו נגיף הפטיטיס C רקומביננטי או HCV, המורכב מגנום RNA מהונדס המקודד מדווח לוציפראז מופרש.

הליפופרוטאינים הנגיפיים מקיימים אינטראקציה עם הפרוטאוגליקנים בתאי המארח, בעוד שגליקופרוטאינים של המעטפת הנגיפית נקשרים לקולטני מארח ספציפיים.

בבארות נבחרות, הוסף את תרכובת הבדיקה הנקשרת לגליקופרוטאינים ויראליים.

עם הדגירה בטמפרטורה פיזיולוגית, הנגיפים הקשורים עוברים אנדוציטוזה.

השליכו את הנגיפים הלא מופנמים, הוסיפו מצע גידול ודגרו.

בבארות הלא מטופלות, הגליקופרוטאינים מסייעים לאיחוי אנדוזום מעטפת ויראלי, ומשחררים את הנוקלאוקפסיד, בעוד שמיסוך מורכב פוגע באיחוי בבארות המטופלות.

עם שחרורו, ה-RNA מבטא חלבונים נגיפיים, כולל לוציפראז המופרש מחוץ לתא

.

קצרו את הסופרנטנט המכיל לוציפראז והוסיפו מצע ביו-לומינסצנטי, שמתחמצן על ידי לוציפראז כדי לפלוט אור.

ירידה בזוהר בבארות המטופלות בהשוואה לבארות הלא מטופלות מעידה על עיכוב של היתוך מעטפת נגיפית-אנדוזום.

לבדיקת היתוך וכניסה וכניסה ויראליים, יש לקרר מראש את צלחת תרבית התאים ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר הדגירה הלילית לחיבור התאים. הסר את המדיום הקיים מהבארות, והדביק את התאים ב-10 עד ה-FFU HCV השני על קרח.

דגרו את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS קר כקרח כדי להסיר את הנגיף שאינו נדבק. לאחר מכן, על קרח, טפלו בתאים בתרכובת בדיקה מומסת במדיום בסיסי או במדיום בסיסי עם 1% DMSO כביקורת, ודגרו על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. זה מאפשר הערכה של תרכובות הבדיקה בכניסה לנגיף, המתרחשת ב-37 מעלות צלזיוס.

שאפו את המדיום ושטפו את הנגיפים הלא מופנמים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של מאגר ציטראט או PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום בסיסי לבאר, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות נוספות. אסוף את הסופרנטנט ובצע את בדיקת גאוס לוציפראז כפי שהודגם קודם לכן לאיתור מדווח הלוציפראז המשוחרר.