זיהוי קולורימטרי של סמן ביולוגי חיידקי באמצעות בדיקת לקמוס שונה

התחילו עם DNA מבקע RNA, DNA קטליטי שכאשר הוא נקשר לסמן ביולוגי חיידקי ספציפי, מופעל.

ה-DNAzyme מקושר לחרוז מגנטי מצופה סטרפטווידין באמצעות ביוטין בקצה ה-5' שלו. בקצה ה-3', הוא קשור לאוראז המקושר לאוליגונוקלאוטיד, ויוצר חרוז מגנטי פונקציונלי.

לצינור המכיל חרוזים מגנטיים פונקציונליים, הוסף ליזט E. coli.

סמן ביולוגי ספציפי של E. coli מהליזאט, מפעיל את ה-DNAzyme, מפעיל פיצול של קישור ה-RNA, וגורם לניתוק של מצומד ה-DNAzyme-urease.

השתמש במעמד מגנטי כדי לשתק את החרוזים ולהסיר את מצומד ה-DNAzyme-urease הקשור לחרוזים.

העבירו את הסופרנטנט המשוחרר המכיל אוראז לצינור אחר.

הוסף צבע אינדיקטור pH - פנול אדום, ותמיסת אוריאה.

האוראז מבצע הידרוליזה של אוריאה לאמוניה ופחמן דו חמצני.

אמוניה, בסיס חלש, מעלה את ה-pH של התמיסה, וגורמת לשינוי צבע, המעיד על נוכחות הסמן הביולוגי E. coli.

לאחר הכנת תאי E. coli על פי פרוטוקול הטקסט, יש לשטוף מראש צינור מיקרופוגה בנפח 1.5 מיליליטר על ידי הוספה ומערבולת של 100 מיקרוליטר RB. לאחר מכן, השליכו את המאגר.

הוסף 15 מיקרוליטר של EC1 מורכב לצינור השטוף, ולאחר מכן, הנח את הצינור על המתלה המגנטי ושאף את הסופרנטנט. הסר את הצינור מהמתלה, הוסף 100 מיקרוליטר RB והשהה בזהירות את החרוזים המגנטיים.

לאחר שימוש ב-RB לשטיפת החרוזים פעמיים נוספות והסרת ה-RB, הוסף 10 מיקרוליטר של דגימת E. coli לשפופרת, וערבב בעדינות את התוכן על ידי הקשה על הצינור. לאחר מכן, דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר הדגירה מוסיפים 90 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים, ומניחים את הצינור על המדף המגנטי. לאחר כשלוש דקות של הפרדה מגנטית, העבירו בזהירות 85 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרופוגה של 0.5 מיליליטר.

חשוב מאוד לזרוק את התמיסה בזהירות מבלי לקחת אף אחד מהחרוזים המגנטיים. חרוזים אלה עמוסים באוראז וייצרו אות חיובי כוזב.

הוסף 15 מיקרוליטר של 0.04% פנול אדום ו -100 מיקרוליטר תמיסת מצע. לאחר מכן, צלם תמונות במרווחי זמן ספציפיים כדי לתעד שינוי צבע.