בדיקת כתב לוציפראז לחקר ויסות תרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח

קחו קומפלקסים של טרנספקציה הכוללים mRNAs מדווחים המקודדים עבור לוציפראז גחלילית, או Fluc, ו-Renilla luciferase, או Rluc.

Fluc mRNA מכיל רצף פוליאדנוזין 5', או מוביל פולי (A), בעוד ש-Rluc mRNA חסר רצף זה.

להעביר תאי יונקים לא נגועים ואבעבועות כדי לספק את ה-mRNA המדווח, ולדגור.

בתאים לא נגועים, גורמי התחלה אוקריוטיים נקשרים לכובע 5' של ה-mRNA, ואחריו גיוס של תת-היחידה הריבוזומלית הקטנה ו-tRNA יוזם.

כאשר תת-היחידה הקטנה מאתרת את קודון ההתחלה, תת-היחידה הגדולה מצטרפת לסינתזה של חלבוני לוציפראז.

בתאים נגועים, זרחון בתיווך נגיף האבעבועות של תת-היחידה הקטנה גורם להרכבת ריבוזום ישירות על רצף המנהיג, מה שמשפר את ייצור הפלוק.

ליז את התאים כדי לשחרר את הלוציפראזות.

הוסף את מצע הפלוק, שהאנזים מתחמצן ופולט אור. בעזרת קורא צלחות, מדוד את הזוהר.

חזור על השלב עבור Rluc כדי לקבוע את העלייה היחסית בזוהר Fluc בהשוואה ל-Rluc בתאים נגועים בנגיף.

זרעו תאי HeLa בצלחת של 24 בארות כדי להשיג מפגש של 80% עד 90% למחרת, ודגרו למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. להדביק תאי HeLa בנגיף Vaccinia בריבוי הדבקה של 5 ולשמור על תאי HeLa לא נגועים להשוואה, ואז לדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 12 שעות. לאחר השעות הרצויות לאחר ההדבקה, יש לערבב 480 ננוגרם ש