שיטת צלחת מיקרוטיטר להערכת הריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה

קח צלחות מיקרוטיטר המכילות אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד מדוללת סדרתית. אחת הצלחות מכילה NTBC, תרופה סינתטית.

הכירו את Pseudomonas aeruginosa, חיידק גרם שלילי, ודגרו.

החיידקים מייצרים פיומלנין - פיגמנט חוץ-תאי מגן - בבארות שלא טופלו ב-NTBC, בעוד שהתרופה מונעת ייצור פיומלנין.

האנטיביוטיקה הקטיונית נקשרת לליפופוליסכרידים אניוניים, או LPS, על הממברנה החיצונית של החיידקים, עוקרת את הגשרים הקטיוניים ומערערת את יציבות הממברנה.

עם כניסת החיידקים, האנטיביוטיקה נקשרת לאתר האמינואציל, או אתר A, בתת-היחידה הריבוזומלית 30S.

האנטיביוטיקה הקשורה מונעת את קשירת האמינואציל-tRNA ואת התנועה הריבוזומלית על פני mRNA, מפריעה לסינתזת החלבון ומעכבת את צמיחת החיידקים.

לאחר הדגירה, מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות כדי להעריך את צמיחת החיידקים.

ריכוז האנטיביוטיקה הנמוך ביותר המונע צמיחת חיידקים הוא הריכוז המעכב המינימלי או MIC.

ערכי MIC דומים עבור בארות שטופלו ב-NTBC ולא טופלו ב-NTBC מצביעים על כך שאין השפעה של NTBC על הרגישות לאנטיביוטיקה של חיידקים.

יום אחד לפני בדיקת ה-MIC, הכינו תרביות של הזנים שייבדקו ב-LB עם ובלי 2-[2-nitro-4-trifluoromethyl)benzoyl]-1-3 cyclohexanedione או NTBC. הדגמה זו משתמשת ברמה המייצגת של 300 מיקרו-טוחנות של NTBC. שיטת הטיטרציה לקביעת הריכוז המתאים של NTBC מתוארת בטקסט הפרוטוקול. דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אוורור. למחרת, הכינו פתרונות מאסטר של LB פלוס NTBC ו-LB פלוס DMSO עבור בדיקת המיקרופון.

כדי לבדוק אנטיביוטיקה אחת לזן אחד, הוסף 600 מיקרו-מולרית של NTBC ל-2 מיליליטר LB, וערבב כדי ליצור את תמיסת המאסטר של NTBC. NTBC מתווסף בריכוז של 600 מיקרו-טוחנות מכיוון שהוא ידולל פי שניים עם הוספת החיסון, מה שיניב ריכוז סופי של 300 מיקרו-טוחנות. הוסף נפח שווה ערך של ה-DMSO של הרכב ל-2 מיליליטר של LB וערבב כדי ליצור את הפתרון הראשי ללא NTBC. שני פתרונות האב הללו ישמשו ליצירת פתרונות מלאי אנטיביוטיקה וכן להקמת סדרת הדילול בצלחות של 96 בארות.

לאחר מכן, הכינו את תמיסות האנטיביוטיקה בתמיסות המאסטר LB פלוס NTBC או LB פלוס DMSO. הכן את תמיסת מלאי הגנטמיצין פלוס מינוס NTBC ב 64 מיקרוגרם למיליליטר. הכינו את תמיסת המלאי של קנמיצין פלוס או מינוס NTBC ב-256 מיקרוגרם למיליליטר. הכן את תמיסת הטוברמיצין פלוס או מינוס NTBC ב-8 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר ייצור תמיסות האנטיביוטיקה 2X, הוסף 100 מיקרוליטר מכל תמיסת אנטיביוטיקה לארבע בארות בצלחת של 96 בארות בשורה A. לדוגמה, יש למקם גנטמיצין ב-A1 עד A4. יש למקם את Kanamycin ב-A5 עד A8, ואת ה-tobramycin יש למקם ב-A9 עד A12.

הוסף 50 מיקרוליטר של פתרון המאסטר LB פלוס NTBC או LB פלוס DMSO לשורות B עד H של לוח 96 הבארות. ודא שצלחת אחת היא LB בתוספת NTBC וצלחת אחת היא LB בתוספת DMSO. בעזרת כותרת מיקרופיפטה, בצע דילול סדרתי כפול של האנטיביוטיקה על ידי העברת 50 מיקרוליטר מהתמיסה משורה A לשורה B. מערבבים את התמיסה, מחליפים את קצות הפיפטה ומעבירים 50 מיקרוליטר מהתמיסה משורה B לשורה C. חזור על הפעולה עבור השורות הנותרות.

לאחר דילול שורה G, הסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה מאותה שורה והשליך. השתמש בשורה H כאמצעי בקרה ללא אנטיביוטיקה לצמיחת חיידקים. אחזר את תרביות הלילה. לאחר שטיפת כל התרבויות כדי לחסל את הביו-מלנין הקיים בתקשורת, מדוד את ה-OD₆₀₀ של התרבויות. לדלל את תרביות הלילה ב- LB.

בעזרת מיקרופיפטה רב-ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר מתרבית החיידקים המדוללת לבארות המתאימות. הוסף חיידקים לשלוש בארות עבור כל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסף 50 מיקרוליטר LB לבאר הרביעית כדי לשמש כבקרה לזיהום חיידקי. מכסים את צלחות 96 הבארות בפרפילם ודוגרים כ-24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, בדוק את הצלחות חזותית לגידול חיידקים בבארות. ה-MIC הוא הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבו לא נראית צמיחת חיידקים עבור כל שלושת השכפולים של כל זן.