בדיקה לחקר ההשפעה של נוקשות מטריצה חוץ-תאית על זיהום חיידקי

קחו בארות המכילות הידרוג'לים פוליאקרילאמיד בעלי קשיחות משתנה המכוסים בקולגן, המחקים מטריצה חוץ-תאית פיזיולוגית, או ECM.

הוסף תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים היוצרים הידבקויות מוקדיות, או FAs - קומפלקסים המתווכים את קשירת התא ל-ECM - כדי לחוש בנוקשות ההידרוג'ל.

הידרוג'לים נוקשים יותר מעלים את ביטוי פני התא של וימנטין, מרכיב ציטו-שלד, בהשוואה להידרוג'לים רכים יותר.

הוסף חיידקי ליסטריה מונוציטוגנס, המהונדסים לבטא חלבון פלואורסצנטי תחת המקדם לחלבון המעורר הרכבה של אקטין, או ActA.

צנטריפוגה לסנכרון מגע חיידקים עם תאי המארח, ודגירה.

החיידקים נקשרים לווימנטין. יותר וימנטין על תאי המארח הנוקשים יותר הקשורים להידרוג'ל מוביל ליותר היצמדות חיידקים ואנדוציטוזיס.

הוסיפו אנטיביוטיקה, והסירו חיידקים לא מופנמים.

החיידקים המופנמים מפרישים רעלים, וקורעים את קרום האנדוזום. בריחה ציטופלזמית מפעילה את מקדם ה-ActA כדי לבטא את החלבון הפלואורסצנטי, ולסמן חיידקים תוך-תאיים.

נתק את התאים באופן אנזימטי. באמצעות ציטומטריית זרימה, זהה פלואורסצנטיות גבוהה יותר בתאי מארח השוכנים על הידרוג'לים נוקשים יותר, מה שמעיד על הפנמת חיידקים גדולה יותר.

לאחר הכנת תרבית לילה של L. monocytogenes על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 1 מיליליטר מהתרבית לצינור מיקרו-צנטריפוגה, וסובבו אותו בטמפרטורה של 2,000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. לאחר שימוש ב-PBS בדרגת תרבית רקמות כדי לשטוף את הגלולה פעמיים, השתמש ב-1 מיליליטר של PBS כדי להשעות מחדש את הגלולה.

הכן את תערובת הזיהום על ידי שילוב של 10 או 50 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים עם 1 מיליליטר של מדיום מלא MCDB-131 לריבוי זיהום, או MOI, של כ-50 חיידקים לכל תא מארח או 10 חיידקים לכל תא מארח. הסר את המדיום מבארות צלחות 24 הבארות, הקפד לא לשבש את ההידרוג'לים או את התאים. השתמש ב-1 מיליליטר של מדיום מלא MCDB-131 כדי לשטוף את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסף 1 מיליליטר של החיידקים לכל באר.

הניחו את המכסה על הצלחות, ועטפו אותם בניילון מזון מפוליאתילן כדי למנוע דליפה. צנטריפוגה של הלוחות ב-2,000 פעמים גרם למשך 10 דקות כדי לסנכרן את הפלישה. לאחר מכן, דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עם מדיום מלא MCDB-131, שטפו את הדגימות 4 פעמים והחזירו אותן לחממת תרבית הרקמות. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיום במדיום מלא MCDB-131 בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.

כדי לבצע ציטומטריית זרימה שמונה שעות לאחר ההדבקה, הסר את המדיום מהבארות של צלחת 24 הבארות, והשתמש בתרבית רקמות PBS כדי לשטוף את הבארות פעם אחת. לאחר הסרת ה-PBS, הוסף 200 מיקרוליטר של תערובת טריפסין-EDTA-קולגנאז לכל באר. מניחים את המנה בחממת תרבית הרקמה למשך 10 דקות כדי לאפשר ניתוק מלא של התאים.

לאחר פיפטינג עדין של כל באר שמונה פעמים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום מלא כדי לנטרל את הטריפסין. העבירו את 400 מיקרוליטר תמיסת התאים מכל באר לצינור פוליסטירן של 5 מיליליטר עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר. נתח את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה.