$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
קח צלחת מרובת בארות עם חד-שכבות חד-שכבתיות של תאי אנדותל אנושיים דביקים על הידרוג'לים פוליאקרילאמיד מצופים קולגן בעלי קשיחות משתנה.
תאים על הידרוג'לים נוקשים יותר עוברים ארגון מחדש משמעותי של השלד התא, מה שמגביר את המתח התוך תאי, בהשוואה להידרוג'לים רכים יותר.
שטפו תאים במדיה והוסיפו ליסטריה מונוציטוגנס מהונדסים - המבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת מקדם החלבון המעורר הרכבה של אקטין (ActA).
צנטריפוגה כדי להקל על מגע בין תאים לחיידקים. דגירה כדי לתווך אנדוציטוזיס חיידקית.
שטפו עם מדיה. טפל בגנטמיצין כדי לחסל חיידקים לא מופנמים. דגירה.
חיידקים מופנמים משחררים רעלנים יוצרי נקבוביות, ומשבשים את הממברנות הפגוזומליות. חיידקים ציטוזוליים מווסתים את ביטוי ActA וחלבון פלואורסצנטי, ומסמנים חיידקים תוך-תאיים.
חלבוני ActA גורמים לפילמור אקטין, יוצרים זנב שביט אקטין המניע את החיידקים קדימה, גורם להפנמה על ידי תאים שכנים ומקדם את התפשטותם.
לאחר הדגירה, השתמש במדיה המכילה צבע כדי לצבוע גרעיני תאים. יש להחליף את המדיה במדיה המכילה גנטמיצין.
בצע מיקרוסקופיה דולג זמן.
הידרוג'לים רכים יותר מקדמים התפשטות מהירה של חיידקים בין-תאיים בהשוואה להידרוג'לים נוקשים יותר עם מתח תוך תאי מוגבר, מה שמרמז על התפשטות חיידקים תלויה בנוקשות המטריצה.
לאחר הכנת תרבית לילה של L. monocytogenes על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 1 מיליליטר מהתרבית לצינור מיקרו-צנטריפוגה, וסובבו אותו בטמפרטורה של 2,000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. לאחר שימוש ב-PBS בדרגת תרבית רקמות כדי לשטוף את הגלולה פעמיים, השתמש ב-1 מיליליטר של PBS כדי להשעות מחדש את הגלולה.
הכן את תערובת הזיהום על ידי שילוב של 10 או 50 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים עם 1 מיליליטר של מדיום מלא MCDB-131 לריבוי זיהום, או MOI, של כ-50 חיידקים לכל תא מארח או 10 חיידקים לכל תא מארח. הסר את המדיום מבארות צלחות 24 הבארות, הקפד לא לשבש את ההידרוג'לים או את התאים.
השתמש ב-1 מיליליטר של מדיום מלא MCDB-131 כדי לשטוף את התאים פעם אחת, ולאחר מכן הוסף 1 מיליליטר של החיידקים לכל באר. הניחו את המכסה על הצלחות, ועטפו אותם בניילון מזון מפוליאתילן כדי למנוע דליפה. צנטריפוגה של הלוחות ב-2,000 x g למשך 10 דקות כדי לסנכרן את הפלישה. לאחר מכן, דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עם מדיום מלא MCDB-131, שטפו את הדגימות 4 פעמים והחזירו אותן לחממת תרבית הרקמות. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיום במדיום מלא MCDB-131 בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.
לאחר זריעת תאי HMEC-1 על הידרוג'לים של PA וטיפול בגנטמיצין על פי פרוטוקול הטקסט, דגרו את הצלחת למשך חמש שעות כדי לאפשר למקדם ActA להידלק ולהניע את הביטוי של מסגרת הקריאה הפתוחה mTagRFP.
ארבע שעות לאחר ההדבקה, ערבבו 1 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל צבע Hoechst עם 1 מיליליטר של L15 בינוני מלא והוסיפו אותו לכל באר כדי להכתים את הגרעינים. לאחר דגירה של התאים למשך 10 דקות, החלף את המדיום ב-1 מיליליטר של מדיום מלא L15 בתוספת 20 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין.
צלם מיקומים מרובים כל 5 דקות באמצעות תכונת פוקוס אוטומטי כדי לנטר כיצד חיידקי LM מתפשטים דרך חד-שכבות HMEC-1 שנזרעו על הידרוג'לים קשיחים משתנים.