בדיקה לקביעת התחלת ביופילם רב-מיקרוביאלי על תאים נגועים בנגיף

קח צלחת מרובת בארות המכילה חד-שכבות של תאי יונקים.

בארות בדיקת זרעים עם נגיף הרפס סימפלקס. בארות בקרה חסרות את הנגיף.

הנגיף נצמד להפראן סולפט על פני התא ומופנם באמצעות אנדוציטוזיס.

זיהום בנגיף מעורר הפרשת הפרנאז, אשר מבקעת את הפראן סולפט וחושפת קולטנים פטרייתיים ספציפיים.

דגירה משותפת של התאים עם צינורות נבט סטפילוקוקוס זהוב וקנדידה אלביקנס.

בתאים נגועים בנגיף, דלדול הפראן סולפט מעכב אינטראקציה חיידקית תוך קידום אינטראקציות עם קולטנים פטרייתיים, ומונע לוקליזציה משותפת של חיידקים-פטריות.

בתאי ביקורת, חיידקים מקיימים אינטראקציה עם הפראן סולפט, בעוד שפטריות נקשרות לקולטנים זמינים.

קו-לוקליזציה מיקרוביאלית זו יוזמת היצמדות - הצעד הראשון ביצירת ביופילם.

לאחר הדגירה, הסר חיידקים לא קשורים. כיסוי עם מאגר ליזה, משחרר חיידקים ופטריות למדיה.

מורחים את ליזאט התא על צלחות המכילות אמצעי גידול. דגירה להיווצרות מושבה.

ירידה במושבות חיידקים עם עלייה מקבילה במושבות פטרייתיות מצביעה על עיכוב המושרה על ידי וירוס של לוקליזציה משותפת של חיידקים-פטריות והתחלת ביופילם.

כדי לבצע בדיקת ביופילם פולימיקרוביאלית, זרעו צלחות של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר של 2 פעמים 10 לתאי HeLa החמישיים למיליליטר. נענעו את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 45 דקות, לפני הדגירה ב-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. השתמש באופטימום 1x כדי לשטוף את החד-שכבות. לאחר מכן, זרע עם זן יחיד של HSV. בדקו רק זן אחד בכל פעם.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב -5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות. בעזרת 100 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS עם מגנזיום וסידן, שטפו את החד-שכבות הנגועות. לאחר מכן, השתמש ב-37 מעלות צלזיוס HBSS כדי להחליף את ה-PBS. השאירו 25 מיקרוליטר של HBSS בכל באר.

לאחר מכן, הוסיפו מתלי עבודה GT ו/או S. aureus, ודגרו את הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שאפו עמוד אחד של הצלחת בכל פעם. מלאו מיד את הבארות באמצעות 300 מיקרוליטר PBS עם מגנזיום וסידן.

לאחר חזרה על שלב הכביסה הזה פעמיים, הוסף 200 מיקרוליטר בדילול של 1 עד 50 של מאגר ליזה RIPA מעוקר מסנן לכל באר.

כאשר עובדים עם זנים אחרים של חיידקים או פטריות, ודא שריכוז ה-RIPA המשמש מספיק לליזה של תאים, אך עדיין מתירני לבדיקת כדאיות מיקרוביאלית.

טריטוציה מהירה של ליזאט תאי HeLa, ופיפטה 50 מיקרוליטר על מלחי מניטול ו/או מדיום פטרייתי. לאחר מכן, בעזרת מוט זכוכית כפוף בזווית של 90 מעלות, מורחים את הליזט על פני הצלחת.

לאחר דגירה של הצלחות למשך 18 שעות, ספרו ידנית את מספר המושבות לצלחת. הביקורת מורכבת מהיצמדות של S. aureus ו/או C. albicans לתאי HeLa לא נגועים ב-HSV.