אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:56 דק׳ • July 8th, 2025
התחל בזריעת תרבית חיידקים לתוך צלחת בדיקה. לאחר מכן, דגרו על הצלחת.
לתאי החיידקים יש הידבקויות ופילי על פני השטח המאפשרים להם להיצמד זה לזה וליצור אגרגטים קטנים.
הוסף ריכוזי אנטיביוטיקה משתנים לבארות, והשאיר אחת ללא טיפול לבקרה.
מולקולות האנטיביוטיקה מקיימות אינטראקציה עם חיידקים רגישים, משפיעות על יכולתם לגדול ולהתרבות, מה שמוביל למותם.
החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה נשארים פעילים מבחינה מטבולית, ומייצרים מולקולות ATP.
השתמש בסוניקטור כדי לשבש את תאי החיידקים, לשחרר את התוכן התוך תאי שלהם, כולל ATP.
הוסף מגיב זוהר לניצול ATP המכיל לוציפרין, אנזים לוציפראז וגורמים משלימים אחרים.
לוציפראז משתמש ב-ATP ובחמצן כדי להמיר לוציפרין לאוקסילוציפרין מעורר.
האוקסילוציפרין עובר לאחר מכן למצב הקרקע שלו, ופולט אור זוהר.
מדוד את הספיגה באמצעות קורא צלחות.
הירידה בספיגה בריכוזים גבוהים יותר של אנטיביוטיקה מצביעה על ייצור ATP נמוך יותר, מה שמעיד על שיעור הישרדות מופחת של חיידקים.
מדוד את הצפיפות האופטית ב-650 ננומטר או OD650 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים המרחפים, והתאם את ריכוז ה-GC לכ-1 x 108 יחידות יוצרות מושבה למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 99 מיקרוליטר של תרחיף ה- GC לבארות בודדות של צלחת של 96 בארות, ואפשר לחיידקים להצטבר ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 6 שעות.
בתום הדגירה, הוסיפו 1 מיקרוליטר של צפטריאקסון מדולל סדרתי לכל באר, והשאירו כמה בארות ללא טיפול שישמשו כבקרות, והחזירו את הצלחת לחממה למשך 24 שעות נוספות. למחרת, סוניקציה של המתלה בכל באר שלוש פעמים ב-144 וואט ו-20 קילו-הרץ למשך 5 שניות לכל סוניקציה, והוסף 100 מיקרוליטר של מגיב זוהר ניצול ATP זמין מסחרית לכל באר.
העבירו בזהירות 150 מיקרוליטר של תערובת מכל באר לבארות בודדות של מיקרו-פלטה שחורה חדשה של 96 בארות ומדדו את הספיגה של כל באר ב-560 ננומטר על קורא צלחות. לאחר מכן, חשב את שיעור ההישרדות לפי היחס בין הקריאה המתקבלת לאחר טיפול אנטיביוטי סדרתי לקריאה מהבארות הלא מטופלות.