קביעת תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים ברגישות תאי לימפומה לתרופה ניסיונית

קח צלחת מרובת בארות המכילה מונוקולטורות ספרואידיות תלת מימדיות של תאי לימפומה, תאי דם לבנים סרטניים ותרביות משותפות של לימפומה ותאים דמויי נויטרופילים במטריצת קרום בסיס.

הוסף תרופת בדיקה שנקשרת לטובולין תוך-תאי ומשבשת את פילמור המיקרו-צינורות, וכתוצאה מכך אפופטוזיס תאי.

בתרבית המשותפת, מגע ישיר של תאי לימפומה מפעיל את התאים דמויי הנויטרופילים, וגורם להפרשת ציטוקינים.

ציטוקינים אלה מקיימים אינטראקציה עם קולטני תאי לימפומה, מפעילים מפלי איתות במורד הזרם ומווסתים את ביטוי החלבון האנטי-אפופטוטי, ומקדמים את הישרדות התאים.

השלך את המדיה. הוסף מאגר דיסוציאציה כדי לשבש את ההידבקות התאית.

מגרדים את הספרואידים ומדגרים אותם תחת תסיסה. העבירו את המתלה לצינורות והמשיכו בתסיסה ליצירת מתלים חד-תאיים.

הציגו קוקטייל נוגדנים מצומד פלואורופור המסמן לימפומה ותאים דמויי נויטרופילים.

הוסף נספח V מתויג פלואורופור ופרופידיום יודיד כדי לסמן תאים אפופטוטיים ומתים.

באמצעות ציטומטריית זרימה, לזהות הישרדות מוגברת של תאי לימפומה בתרבית המשותפת, מה שמעיד על הגנה מתווכת נויטרופילים מפני התרופה.

כדי להקים תרבית משותפת תלת מימדית, הוסף 50,000 תאי לימפומה B RL בלבד, או ערבב עם תאים מובחנים HL60 בצינורות סטריליים של 15 מיליליטר.

סובב את הדגימות והשהה מחדש את הכדורים ב -300 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף באמצעות קצה פיפטה של 1 מיליליטר כאשר הפתח נחתך ל -2 עד 3 מילימטרים. לאחר מכן, דגרו 300 מיקרוליטר מהתאים בכל באר של צלחת של 24 בארות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

בתום הדגירה מוסיפים 1 מיליליטר של מדיום RPMI שלם לכל באר, וחוזרים לתרביות תלת מימד לחממה למשך שבעה ימים נוספים עם החלפת מדיום כל יומיים. ביום החמישי, הוסף 10 ננו-מולארי וינקריסטין לתרביות.

לאחר שבוע של תרבית, יש לשאוב את המדיום ולשטוף כל באר פעמיים עם 1 מיליליטר PBS קר כקרח. לאחר מכן, הוסיפו 3 מיליליטר PBS קר כקרח עם EDTA לכל באר, וגרדו את קרקעית הבארות עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לנתק את הג'לים. מנערים את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את מתלי התאים לצינורות סטריליים בודדים של 15 מיליליטר לנער עדין על קרח למשך 30 דקות נוספות.

אשר את המראה של תרחיף תאים הומוגני. לאחר מכן, סובב את התאים, ולאחר מכן שטיפת PBS, והשהה מחדש את הכדורים ב-PBS טרי עם FBS. לבסוף, סמן את התאים עם הנוגדנים המתאימים וצבעי הכדאיות כפי שהודגם זה עתה, ונתח את התאים המובחנים RL ו-HL60 על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית השער המאוירת.