מחקר זרימה חוץ גופית של השפעת תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים

קח תאי זרימה שהורכבו מראש המחוברים למערכות זרימה עם מסנני טרנסוול: אחד עם מונוקולטורה אנדותל למעלה והשני עם תרבית אנדותל למעלה ותאי סטרומה בתחתית.

שני התאים מטופלים מראש בציטוקין פרו דלקתי.

במונוקולטורה, ציטוקינים מפעילים תאי אנדותל, ומווסתים את ביטוי מולקולות ההדבקה.

עם זאת, דיבור צולב בין תאי סטרומה ותאי אנדותל בתרבית המשותפת מוביל לתאי סטרומה המייצרים מתווכים רגולטוריים המווסתים את תגובת תאי האנדותל לציטוקינים פרו-דלקתיים.

מקם את החדר על שלב מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך.

הציגו תרחיף נויטרופילים.

נויטרופילים מגויסים ונקשרים למולקולות ההידבקות של האנדותל באמצעות אינטראקציות דבק חולפות, מה שמקל על האינטראקציה שלהם עם כימוקינים הקשורים לפני השטח ומתגלגל לאורך האנדותל.

אינטראקציה זו מפעילה את האינטגרינים על נויטרופילים, מייצבת את ההדבקה וכתוצאה מכך גלגול על פני תאי האנדותל.

עם זאת, בתרבית המשותפת, תגובת האנדותל המווסתת מביאה לגיוס נויטרופילים מדוכא.

דמיין את התרביות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להעריך את גיוס הנויטרופילים מהזרימה.

עבור דגם המסנן, חתוך תחילה חתיכת Parafilm לגודל זהה לכיסוי הזכוכית, באמצעות תבנית מתכת. לאחר מכן, גזרו חריץ של 20 על 4 מילימטר ב-Parafilm באמצעות תבנית מתכת ליצירת תעלת הזרימה. השתמש באטם Parafilm כדי לסמן את תעלת הזרימה על החלקת מכסה הזכוכית. יישר את הקצוות של מסנן שש הבארות על החלקת מכסה הזכוכית. ודא שהמסנן מכסה את סימוני ערוץ הזרימה. גזרו בזהירות את המסנן בעזרת אזמל מסוג 10A.

לאחר מכן, כסו בזהירות את המסנן באטם Parafilm, וודאו כי חריץ תעלת הזרימה נמצא באמצע המסנן. השתמש בחתיכת טישו נקייה ודחף החוצה את כל הבועות. כעת, הנח את הכיסוי בשקע הצלחת התחתונה של תא הזרימה של פרספקס.

מקם את לוחית הפרספקס העליונה מעל החלק העליון של האטם, והברג את הלוחות יחד. סובב את הברז התלת-כיווני כדי לאפשר למאגר הכביסה PBS-A לזרום דרך השסתום. לאחר מכן, חבר את צינור המונומטר ליציאת הכניסה של לוחית הפרספקס העליונה. הפעל את PBS-A דרך ערוץ הזרימה כדי לאפשר לבועות לעבור דרכו.

לאחר מכן חבר את צינור המונומטר ממשאבת המזרק ליציאת היציאה של לוחית הפרספקס. נקה כל PBS-A שטפטף על הצלחת העליונה של החדר. לבסוף, הנח את החדר על הבמה של מיקרוסקופ ניגוד פאזה הפוך, והתאם את המיקוד כדי לדמיין את תאי האנדותל מעל המסננים.

כדי להחדיר לויקוציטים על תאי אנדותל, הגדר את משאבת המזרק למילוי מחדש ולחץ על הפעל. לאחר שהמוקד הותאם כדי לדמיין את חד-שכבת תא האנדותל, הכניסו שני מיליליטר של נויטרופילים מטוהרים למאגר הדגימה, והשאירו להתחמם למשך שתי דקות. לאחר מכן, שטפו את האנדותל עם PBS-A למשך שתי דקות. הפעל את השסתום כדי להחדיר נויטרופילים מעל האנדותל. העבירו את בולוס הנויטרופילים למשך ארבע דקות. כבה את השסתום והחדיר את PBS-A ממאגר הכביסה למשך שארית הניסוי.

בעת ביצוע הניסוי, ודא שבועות אוויר לא יעברו בשום שלב במהלך הבדיקה, מכיוון שהדבר ישבש את חד-שכבת תאי האנדותל, ויגרום לניתוק של נויטרופילים דבקים.

הקלט גיוס נויטרופילים במהלך זרימת נויטרופילים או לאחר הזלפה באמצעות תוכנת לכידת תמונות דיגיטלית. זהה את מרכז התעלה על ידי הזזת המטרה לקצה התעלה ביציאת הכניסה וזיהוי אמצע היציאה. בצע את כל ההקלטות הדיגיטליות של לפחות 5 עד 10 שדות במרכז ערוץ הזרימה.

בזמן הקלטה במהלך זרימת נויטרופילים, צלם תמונות של שדה בודד כל 10 שניות למשך דקה אחת. התקדמו לאורך הערוץ והקליטו שדה נוסף למשך דקה אחת, וחזרו על תהליך זה למשך הבולוס.

להקלטת פוסט-פרפוזיה, בצע הקלטה של 10 שניות של 5 עד 10 שדות במרכז ערוץ הזרימה להערכת התנהגות הלויקוציטים. צלם תמונות בכל שנייה במרווח של 10 שניות. זה מאפשר מספיק זמן ללכידה מהזרימה ולניתוח ההתנהגות של נויטרופילים דבקים.

הקלט שדה בודד המכיל לפחות 10 נויטרופילים שהועברו במשך חמש דקות, וצלם תמונות כל 30 שניות. זה יכול לשמש לחישוב המהירות של תאים נודדים. הקלט סדרה נוספת של שדות של 10 שניות. זה מאפשר לנויטרופילים זמן לנדוד דרך השכבה החד-שכבתית של האנדותל.

לבסוף, עצור את משאבת המזרק, והסר את צינור היציאה ולאחר מכן את צינור הכניסה. פרק את תא הזרימה ושטוף את מאגר הדגימה עם PBS-A. חזור על המסננים וערוצי המיקרו-שקופיות הבאים לפני שתמשיך לניתוח גיוס והתנהגות לויקוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.