כימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי סרטן מזדקנים הנגרמים על ידי טיפול

קח תאים סרטניים שטופלו מראש בתרופה כימותרפית הגורמת להזדקנות באחוז מהתאים.

תאים אלה צוברים גרגירי ליפופוסין אוטו-פלואורסצנטיים, סמן הזדקנות ידוע.

הוסף אנטיביוטיקה שנכנסת לתאים ומעכבת את משאבות הפרוטונים הליזוזומליות, ומונעת החמצה ליזוזומלית.

עלייה ב-pH משביתה את האנזימים הליזוזומליים.

תאים מזדקנים מבטאים יתר על המידה β-גלקטוזידאז ליזוזומלי אפילו ב-pH כמעט ניטרלי, מה שהופך אותו לסמן ביולוגי להזדקנות.

הציגו מצע β-גלקטוזידאז. דגירה.

β-גלקטוזידאז מבצע הידרוליזה של המצע המופנם לתוצר פלואורסצנטי, ומסמן את התאים המזדקנים.

צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

הוסף צבע כדאיות לתא. בתוך תאים חיים, אסטרזות פעילות ממירות את הצבע לתוצר פלואורסצנטי אטום לממברנה. תאים מתים עם שלמות הממברנה שנפגעה נותרים ללא כתמים.

באמצעות ציטומטריית זרימה, זהה את התאים הקיימים המציגים את הסמנים הכפולים ליפופוסין ומצע פלואורסצנטי β-גלקטוזידאז, המעידים על תאים מזדקנים.

כמת את אחוז התאים המזדקנים כדי להדגים את יעילות התרופה.

ראשית, התאם את ה-pH הליזוזומלי של דגימות תאים מתורבתים על ידי הוספת תמיסה של בפילומיצין מיקרו-מולרי A ב-DMEM לכדור התא בריכוז של אחד כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר, ופיפטה לערבוב. דגירה למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס על מסובב במהירות איטית. לאחר מכן, כדי לצבוע בטא-גלקטוזידאז הקשור להזדקנות, הו