שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

הכניסו מושבה פטרייתית הקשורה לצלופן לתרחיף חיידקים המסומן בפלורסנט. הסר את הצלופן ודגירה.

תאי החיידקים נצמדים למשטח הפטרייה באמצעות מולקולות וקולטנים על פני השטח. החיידקים הדבוקים מפרישים חומרים פולימריים חוץ-תאיים המורכבים מפוליסכרידים, חלבונים ו-DNA, לוכדים את תאי החיידקים ויוצרים את הבסיס המבני של הביופילם.

שוטפים את החלק בתמיסת מלח חזקה כדי להסיר חיידקים קשורים באופן רופף

במאגר פוספט, חותכים קטע מהמושבה.

העבירו את החלק למים סטריליים המכילים נבט חיטה, אגלוטינין, או WGA הקשור לצבע פלואורסצנטי אדום.

WGA, חלבון צמחי, נקשר לשאריות N-אצטיל גלוקוזאמין וחומצה סיאלית, ומאפשר לצבע המחובר להאיר על דופן התא הפטרייתית.

שוטפים את החלק במאגר פוספט.

טבלו חלקית שקופית במאגר. תן לקטע לצוף עליו. יש להרים בעדינות כדי שהחלק ישקע ללא הפרעה לביופילם.

הנח מדיום הרכבה, ואחריו כיסוי לניתוח מיקרוסקופי.

לאחר גידול החיידקים בן לילה, צנטריפוגה את התרבית ב-5,000 פעמים גרם למשך שלוש דקות, ולאחר מכן השעו את הגלולה ב-25 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי 0.1 מולרי. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השתמש באותו מאגר כדי להתאים את ריכוז החיידקים הסופי ל-10 עד התאים התשיעי למיליליטר.

מלאו מיקרופלייט בן 6 בארות עם 5 מיליליטר מהתרחיף החיידקי. השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את קרום הצלופן של תרבית הפטרייה לריבועים, עם מושבה אחת על כל קרום. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות ריבועי צלופן המכילים קורים מהמדיום המוצק, והעביר אותם לבארות בודדות של תרחיף החיידקים.

נער בעדינות את המיקרופלטה עד שמושבות הפטריות מנותקות מהצלופן. לאחר מכן, הסר את יריעות הצלופן והשאיר את מושבות הפטריות בצלחת. דגרו את המיקרופלייט בתסיסה עדינה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך זמן מה בהתאם לזנים המשמשים ולשלב שיש לנתח.

עבור P. fluorescens BBc6/L. bicolor, דגרו על התרביות למשך 30 דקות כדי לקבל ביופילמים בשלב מוקדם ועד 16 שעות עבור ביופילמים בוגרים. כדי להסיר חיידקים פלנקטוניים וחיידקים המחוברים אלקטרוסטטית לקורים, שטפו את הפטרייה על ידי העברתה למיקרופלטה חדשה בת 6 בארות מלאה בתמיסת מלח חזקה. נענע בעדינות את הצלחת למשך דקה.

העבירו את הפטרייה למיקרופלטה חדשה בת 6 בארות המכילה 5 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי של 0.1 מולארי. נערו בעדינות את הצלחת במשך שתי דקות, ולאחר מכן העבירו את הפטרייה למאגר טרי.

תוך שמירה על מושבת הפטריות במאגר, השתמש באזמל כדי לחתוך את המושבה בערך לשניים. העבירו מחצית מהמושבה לצביעה לצלחת פטרי המכילה 1 מיליליטר מים סטריליים בתוספת צבע פלואורסצנטי מתאים כדי להמחיש את רשת הפטרייה, כגון נבט חיטה אגלוטינין מצומד ל-Alexa Fluor633. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בחושך.

לאחר הצביעה יש לשטוף את הדגימה על ידי העברתה למכסה צלחת פטרי המכיל 10 מיליליטר של מאגר אשלגן פוספט סטרילי 0.1 מולרי, ולנער בעדינות למשך דקה. טבלו למחצה שקופית במכסה צלחת הפטרי ומקמו בעדינות את החלק החתוך כדי לצוף מעל המגלשה. לאחר מכן, הרם לאט את הצד מתמיסת החיץ ואפשר לדגימה להתיישב בעדינות על המגלשה.

ההיבט העדין ביותר הוא מיקום המדגם בשקופית. כדי למנוע הפרעה בביופילם, יש לטבול את הדגימה ואת השקופית בזמן מיקום הדגימה, ואסור להזיז את הדגימה יותר לפני ההדמיה.

לבסוף, הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה נגד דהייה לדגימה וכסה אותו בכיסוי זכוכית.