ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T באזורי גידול שונים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

התחל עם פרוסת גידול ריאה המכילה תאי T תושבים.

תאי T נודדים דרך המיקרו-סביבה של הגידול ומקיימים אינטראקציה עם תאי גידול ואלמנטים סטרומליים, ומבצעים פונקציות חיסוניות.

הרכב המיקרו-סביבה של הגידול משפיע מאוד על תזוזה ומהירות.

הוסף נוגדנים מובהקים בצימוד פלואורסצנטי כדי לסמן תאי T, תאי גידול ואלמנטים סטרומליים במיקרו-סביבה.

הוסף DAPI, החודר לתאים עם קרום פלזמה פגום כדי לצבוע את הגרעין, ומאפשר הדמיה של אזורים נמקיים בתוך הגידול.

התבונן בדגימה המוכתמת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

בעזרת אור פלואורסצנטי מתאים, בחר אזור גידול מעניין המכיל תאי T תושבים. הערכת כדאיות התאים על ידי הערכת תאים חיוביים ל- DAPI.

לניתוח בזמן אמת, הגדר מרווחי זמן וזמן הקלטה כולל.

כדי ללכוד תמונות z-stack, התחל בעומק מתחת לתאי T המסומנים ולכוד תמונות במרווחי זמן שונים.

השתמש בתוכנת מעקב כדי להשוות את אורך תזוזה של תאי T ואת המהירות הממוצעת באזורי גידול שונים.

לדלל את הנוגדנים הנדרשים המסומנים פלואורסצנטית ואת הצבע הגרעיני הקרינה, DAPI, לריכוזים הסופיים הנדרשים במדיום RPMI נטול פנול אדום. לאחר מכן, הסר את צלחת התרבות מהחממה ובעזרת קצה עדין, שאב את הנוזל בתוך מנקי הנירוסטה.

כעת, מבלי לגעת בפרוסה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של הנוגדנים המדוללים לכל פרוסת גידול. כדי לאפשר מכתים, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לא