ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T באזורי גידול שונים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

התחל עם פרוסת גידול ריאה המכילה תאי T תושבים.

תאי T נודדים דרך המיקרו-סביבה של הגידול ומקיימים אינטראקציה עם תאי גידול ואלמנטים סטרומליים, ומבצעים פונקציות חיסוניות.

הרכב המיקרו-סביבה של הגידול משפיע מאוד על תזוזה ומהירות.

הוסף נוגדנים מובהקים בצימוד פלואורסצנטי כדי לסמן תאי T, תאי גידול ואלמנטים סטרומליים במיקרו-סביבה.

הוסף DAPI, החודר לתאים עם קרום פלזמה פגום כדי לצבוע את הגרעין, ומאפשר הדמיה של אזורים נמקיים בתוך הגידול.

התבונן בדגימה המוכתמת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

בעזרת אור פלואורסצנטי מתאים, בחר אזור גידול מעניין המכיל תאי T תושבים. הערכת כדאיות התאים על ידי הערכת תאים חיוביים ל- DAPI.

לניתוח בזמן אמת, הגדר מרווחי זמן וזמן הקלטה כולל.

כדי ללכוד תמונות z-stack, התחל בעומק מתחת לתאי T המסומנים ולכוד תמונות במרווחי זמן שונים.

השתמש בתוכנת מעקב כדי להשוות את אורך תזוזה של תאי T ואת המהירות הממוצעת באזורי גידול שונים.

לדלל את הנוגדנים הנדרשים המסומנים פלואורסצנטית ואת הצבע הגרעיני הקרינה, DAPI, לריכוזים הסופיים הנדרשים במדיום RPMI נטול פנול אדום. לאחר מכן, הסר את צלחת התרבות מהחממה ובעזרת קצה עדין, שאב את הנוזל בתוך מנקי הנירוסטה.

כעת, מבלי לגעת בפרוסה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של הנוגדנים המדוללים לכל פרוסת גידול. כדי לאפשר מכתים, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלמת שלב הצביעה, בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את הדסקיות. לאחר מכן, הוציאו בעדינות את הפרוסות וטבלו אותן בפנול נטול אדום RPMI1640 בינוני למשך 10 שניות. מניחים את הפרוסות בחזרה על תוספות תרבית התאים ומוסיפים טיפת פנול נטול אדום RPMI1640 מדיום מעל כל פרוסה. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן המשיכו להדמיה.

מספר שעות לפני תחילת ניסוי זה, הגדר את הטמפרטורה של תא החום של המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן, הכן את המיקרוסקופ המוגדר להחדרה מתמדת של פרוסות גידול עם מדיום RPMI מחומצן ללא אדום, ולשאוב את התמיסה לבקבוק איסוף פסולת באמצעות משאבה פריסטלטית.

בעזרת מלקחיים עדינים, הרם את הפרוסה המוכתמת מצלחת שש הבארות, והעביר אותה לצלחת פלסטיק בגודל 35 מילימטר מלאה במדיום RPMI נטול אדום פנול, ולאחר מכן, הניח עוגן פרוסה מעל הפרוסה כדי לתמוך בה. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפטרי הזו על שלב ההדמיה של המיקרוסקופ.

לאחר חיבור קצות הכניסה והיציאה של מערכת הזילוף, הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי לאפשר למדיום המחומצן לעבור דרך צינורות הזילוף. הורד את מטרת הטבילה במים לפרוסה, והתמקד בחלק העליון של הפרוסה עם אור שדה בהיר או באורך הגל המתאים.

לאחר מכן, באמצעות מסננים מתאימים, דמיין ובחר אזור עניין המכיל את כל התאים המסומנים פלואורסצנטית המעניינים, כלומר תאי CD8 T, איי הגידול ותאי הסטרומה החיוביים ל-CD90. הגדר מפגש הדמיה באמצעות עוצמת לייזר וזמני חשיפה מתאימים כדי להתאים לבהירות האותות הפלואורסצנטיים שנצפו. לאחר מכן, הגדר את עובי מחסנית ה-Z לתמונה בתוך פרוסת הגידול.

לאחר מכן, בחר את מרווח הזמן של התמונה Z-stack ואת זמן ההקלטה הכולל כדי לצלם תמונות במרווחי זמן ספציפיים. לאחר לכידת וייצוא התמונות הפלואורסצנטיות, נתח את נדידת תאי CD8 T כמתואר בפרוטוקול הטקסט.