טכניקת ציטומטריה של זרימת FRET לזיהוי צבירת חלבוני כתב המושרה על ידי זרעי טאו

קחו תרבית תאים של יונקים המבטאת את התחום החוזר של החלבון קושר המיקרו-צינוריות טאו.

מדווחי טאו ציטופלזמיים אלה הם בעלי מוטציה הנוטה לצבירה וקיימים כמונומרים.

המדווחים מאוחים לפלואורופור A או B, כאשר ספקטרום הפליטה של הראשון חופף לספקטרום הספיגה של האחרון.

הוסיפו ליפוזום עם זרעי טאו או אגרגטים סיביים של טאו באורך מלא.

עם הכניסה לתא, הליפוזום משחרר את הזרעים בציטופלזמה.

הזרעים המשוחררים מתווכים את הצבירה של כתבי הטאו, ומביאים את הפלואורופור A ליד פלואורופור B.

הוסף טריפסין כדי לנתק את התאים, ואז בצע קיבוע.

נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.

בשל הקרבה בתוך הצבר, בעת עירור, העברת האנרגיה מפלואורופור A ל-B באמצעות אינטראקציה דיפול-דיפול מכונה העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית או FRET.

הפלואורופור הנרגש B פולט אות FRET, שנוכחותו מעידה על צבירת חלבונים.

כדי לצבוע מחדש את תאי החיישן הביולוגי בתנאים סטריליים, שטפו כל קו תאים עם PBS חם ולאחר מכן דגירה של 3 דקות עם Trypsin-EDTA. כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה עם מדיום תרבית חם, והעבירו מיד את התאים לצינור חרוטי.

צנטריפוגה של התאים, והשעיית הגלולה במדיום טרי. לאחר מכן, ספרו את התאים ובצעו דילול תאי מאסטרמיקס של 3,500,000 תאים לכל 13 מיליליטר מדיום. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו לאט 130 מיקרוליטר מהתאים לכל באר של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית