טכניקת ציטומטריה של זרימת FRET לזיהוי צבירת חלבוני כתב המושרה על ידי זרעי טאו

קחו תרבית תאים של יונקים המבטאת את התחום החוזר של החלבון קושר המיקרו-צינוריות טאו.

מדווחי טאו ציטופלזמיים אלה הם בעלי מוטציה הנוטה לצבירה וקיימים כמונומרים.

המדווחים מאוחים לפלואורופור A או B, כאשר ספקטרום הפליטה של הראשון חופף לספקטרום הספיגה של האחרון.

הוסיפו ליפוזום עם זרעי טאו או אגרגטים סיביים של טאו באורך מלא.

עם הכניסה לתא, הליפוזום משחרר את הזרעים בציטופלזמה.

הזרעים המשוחררים מתווכים את הצבירה של כתבי הטאו, ומביאים את הפלואורופור A ליד פלואורופור B.

הוסף טריפסין כדי לנתק את התאים, ואז בצע קיבוע.

נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.

בשל הקרבה בתוך הצבר, בעת עירור, העברת האנרגיה מפלואורופור A ל-B באמצעות אינטראקציה דיפול-דיפול מכונה העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית או FRET.

הפלואורופור הנרגש B פולט אות FRET, שנוכחותו מעידה על צבירת חלבונים.

כדי לצבוע מחדש את תאי החיישן הביולוגי בתנאים סטריליים, שטפו כל קו תאים עם PBS חם ולאחר מכן דגירה של 3 דקות עם Trypsin-EDTA. כאשר התאים התנתקו, עצרו את התגובה עם מדיום תרבית חם, והעבירו מיד את התאים לצינור חרוטי.

צנטריפוגה של התאים, והשעיית הגלולה במדיום טרי. לאחר מכן, ספרו את התאים ובצעו דילול תאי מאסטרמיקס של 3,500,000 תאים לכל 13 מיליליטר מדיום. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו לאט 130 מיקרוליטר מהתאים לכל באר של צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית רקמה שטוחה תוך הקפדה למקם את קצות הפיפטה במרכז הבארות מבלי לגעת בתחתית הצלחת.

לאחר שהתאים הוצפו בצלחת, הניחו להם להתייצב, ללא הפרעה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרו על הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ויותר או שווה ל-80% לחות יחסית. למחרת, כאשר תאי החיישן הביולוגי הם 60% עד 65% מתלכדים, שלב מדיום סרום מופחת, מגיב ליפוזום ומקור זרעים ביולוגי ליצירת קומפלקסים של התמרה.

לאחר מכן, פיפטה בעדינות של 20 מיקרוליטר של קומפלקס התמרה בצד של כל חיישן ביולוגי בודד והחזירו את התאים המטופלים לחממה למשך 24 עד 48 שעות נוספות. לפני הקציר, תאים לא מטופלים יראו רק פלואורסצנטיות מפוזרת. עם זאת, תאים שטופלו בחומר זרעי טאו יראו אגרגטים בהירים לאחר יום עד יומיים.

כדי לקצור את התאים, החלף את מדיום תרבית התאים ב-50 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA, ועצור את התגובה לאחר 5 דקות עם 150 מיקרוליטר של מדיום תרבית מקורר. מיד, העבירו את התאים לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות וגלולה את התאים. שאפו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים, ולאחר מכן השעו בעדינות אך ביסודיות את התאים ב-50 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות. לאחר מכן, סובב שוב את התאים והשהה מחדש את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריה בזרימה צוננת.