JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:37 דק' • July 8th, 2025
לטפל בתרביות עצביות עם ריכוזים הולכים וגדלים של רעלן בדיקה.
הרעלן נכנס לתאים ומשתחרר לציטוזול.
בהתאם לפוטנציאל שלו, הרעלן עשוי למנוע איחוי שלפוחית, ולעכב שחרור נוירוטרנסמיטרים.
החלף את המדיום במאגר המכיל תרכובות נוירו-פרמקולוגיות ספציפיות כדי לחסום פוטנציאל פעולה עצבי.
הניחו את צלחת התרבות על שלב אלקטרופיזיולוגיה. כדי להתחיל להקליט, חבר סומה של תא עצב עם פיפטה המכילה אלקטרודת הקלטה.
הפעל לחץ שלילי קבוע כדי לשאוב חלק ממברנה קטן, וליצור ג'יגה-סיל, אטימה הדוקה המבטיחה הפרעה מינימלית במהלך ההקלטה.
שמור על מתח ממברנה קבוע למדידת זרמים עצביים.
הפעל פעימות לחץ שליליות כדי לקרוע את הממברנה, וליצור מגע ישיר בין הנוירון לפיפטה.
רשום את הזרמים המיוצרים בנוירון עקב ספיגת נוירוטרנסמיטורים, המכונים mEPSCs.
ירידה בתדירות mEPSC עם חשיפה מוגברת לרעלנים מצביעה על עיכוב שחרור נוירוטרנסמיטורים.
לדלל את הסרוטוקסין בוטולינום סרוטיפ A עד פי 100 מהריכוז הסופי הרצוי במדיום תרבית ESN ולחמם ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף נפח מתאים של רעלן לתרביות DIV 21+ ESN. מערבבים את צלחת התרבות וחוזרים לחממה.
בנקודת הזמן הרצויה, שאפו את מדיום תרבית ה-ESN, ושטפו פעמיים עם מאגר הקלטה חוץ-תאי או ERB. לאחר מכן, הוסף 4 מיליליטר של ERB בתוספת 5 טטרודוטוקסין מיקרו-מולרי כדי לחסום פוטנציאל פעולה ו-10 מיקרו-מולרי דו-קוקולין כדי לנטרל את פעילות קולטן GABAA. לאחר מכן, העבירו את המנה למתקן האלקטרופיזיולוגיה. אין צורך בזלוף או בבקרת טמפרטורה לעיכוב נמדד של העברה סינפטית או בדיקת MIST.
לאחר שימוש במושך מיקרו-פיפטה כדי למשוך פיפטות בורוסיליקט עם התנגדות של 5 עד 10 מגה-אוהם, מלא מחדש פיפטה במאגר הקלטה תוך-תאי. לאחר מכן, טבלו בעדינות את הפיפטה במגיב סיליקון. אבטח את פיפטת ההקלטה על מחזיק האלקטרודה והצמד מזרק מלא אוויר לצינור המועבר למחזיק האלקטרודה. ספק לחץ חיובי יציב דרך המזרק תוך הורדת פיפטת ההקלטה לתוך ה-ERB.
לאחר הנחתת פיפטת ההקלטה בעדינות על הסומה של הנוירון להקלטה, תפוס לחץ חיובי על ידי שבירת החותם על המזרק. חברו מחדש את המזרק והפעילו לחץ שלילי מתמשך באמצעות השראה עדינה ליצירת אטימה של ג'יגה-אום. לאחר שנוצר אטם הג'יגה-אוהם, הפחת את מתח ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט, ולאחר מכן הפעל בזהירות פולסים קצרים של לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי לפרוץ לתצורה סיטונאית.
עקוב אחר עליות קיבול למשך 30 שניות כדי לוודא שהתיקון יציב. בטל את קפיצות הקיבול בתוכנת ההאקר, ועבור למצב מהדק נוכחי כדי לנטר ולתעד את פוטנציאל הממברנה במנוחה. ללא התאמה לפוטנציאל צומת נוזלים, פוטנציאל הממברנה במנוחה צריך להיות בין מינוס 67 למינוס 82 מילי-וולט.
כוונן את ההגבר ל-2 מילי-וולט לפיקו-אמפר עבור למצב מהדק מתח ובצע מינוס 70 מילי-וולט רציף, תוך הקלטה למשך 3 עד 5 דקות כדי לזהות זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים זעירים.
נתח 3 עד 5 דקות של נתונים מוקלטים כדי לזהות MEPSCs באמצעות הגדרות ברירת מחדל עבור EPSCs של קולטני AMPA במיני-ניתוח. אסוף ושמור מידע על אירועים שזוהו. לאחר איסוף תדרי mEPSC עבור 8 עד 12 בקרות ו-8 עד 12 דגימות שטופלו בנוירוטוקסין בוטולינום עבור כל מצב חשיפה, נתח את התדירות מול הגיל והבקרות המותאמות.