ייצור וטיהור נוגדנים רקומביננטיים מתאי יונקים

התחל עם שפופרת המכילה וקטורים נפרדים לגנים של נוגדנים בעלי שרשרת כבדה ושרשרת קלה.

הוסף מגיב טרנספקציה ליצירת קומפלקסים עם הווקטורים.

העבירו את התערובת הזו לתאי מארח של יונקים ודגרו להפנמה.

הוסף חומר נוגד גושים כדי לקדם פיזור אחיד של תאים שעברו טרנספטציה, ולשפר את התאוששות התאים וצמיחתם.

הוסף תמיסה אנטי בקטריאלית-אנטי מיקוטית למניעת זיהום.

בתוך התא המארח, הווקטורים משתלבים בגנום המארח.

לאחר שעתוק גנים, mRNA בודדים יוצאים מהגרעין ועוברים תרגום ליצירת שרשראות נוגדנים מתהוות.

קיפול ושינוי נכון של השרשראות המתהוות מניב שרשראות כבדות וקלות.

שרשראות אלו משתלבות ליצירת נוגדנים מתפקדים במלואם, אשר משתחררים לאחר מכן לתווך החוץ-תאי.

קציר את המדיום והצנטריפוגה. מסננים את הסופרנטנט.

העבירו את התסנין דרך עמודת טיהור המאפשרת קשירה סלקטיבית של הנוגדנים.

בעזרת מאגר פליטה, יש להוציא את הנוגדנים המטוהרים.

גדל תאי CHO ב-200 מיליליטר מדיה לתוך צלוחיות ארוכות ומבולבלות של ארלנמאייר. שלב 5 מיליליטר של מדיה בסגנון חופשי CHO עם 50 מיקרוגרם של DNA משובט כבד משתנה ו-75 מיקרוגרם של DNA משובט קל משתנה בשפופרת של 15 מיליליטר. לאחר מכן, מערבול את הצינור. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 750 מיקרוליטר של 1 מיליגרם למלאי פוליאתילן אמין למיליליטר לתמיסת ה- DNA, ומערבל אותו באגרסיביות למשך 30 שניות.

השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות נוספות. הוסיפו את כל התערובת לתאי ה-CHO תוך ניעור ידני של הבקבוק. דגירה מיידית של התאים ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול ב-130 סל"ד.

למחרת, הוסף לתאים 2 מיליליטר של חומר אנטי גושי 100x ו -2 מיליליטר של תמיסה אנטי-פטרייתית אנטיבקטריאלית פי 100. דגרו את הצלוחיות בטמפרטורה של 32 עד 34 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-130 סל"ד. המשיכו לגדל את התאים במשך 10 עד 11 ימים, והוסיפו 10 מיליליטר של מזון טריפטון N1 ו-2 מיליליטר של תוסף גלוטמין פי 100 בכל יום חמישי. ספרו את התאים כל שלושה ימים כדי להבטיח שחיוניות התאים תישאר מעל 80%. ביום 10 או 11, קצרו את המדיום לטיהור נוגדנים על ידי צנטריפוגה של התרבית בטמפרטורה של פי 3,000 גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 60 דקות. לאחר מכן, סנן את המדיה השקופה עם מסנן בקבוק של 0.22 מיקרומטר.

כדי לטהר את הנוגדנים, יש לאזן את עמודת החלבון A עם שני נפחי עמודות של מאגר קשירה. העבירו את המדיה המסוננת דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מיליליטר לדקה. לאחר מכן שטפו את העמודה בשני נפחי עמודות של מאגר כריכה. השתמש ב-5 מיליליטר של מאגר פליטה כדי להוציא את הנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר.