אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:03 דק׳ • July 8th, 2025
קחו דילולים סדרתיים של נוגדן המכוון לנגיף השפעת המגלוטינין, או HA, גליקופרוטאין המורכב מראש כדורי וגבעול.
הוסף את הדילולים על תאי יונקים שעברו טרנספטציה המבטאים HA הקשור לפני השטח. הנוגדנים נקשרים לאזורי גבעול ה-HA ויוצרים קומפלקסים חיסוניים.
להציג תאי T מהונדסים המבטאים קולטני Fc ומקודדים מדווח לוציפראז בשליטת גורם השעתוק NFAT.
במהלך הדגירה, הנוגדן הקשור ל-HA נקשר לקולטן Fc, בעוד שראש ה-HA נקשר לחומצה סיאלית, מה שמפעיל את הפעלת תאי T ומגביר את ריכוז הסידן הציטוזולי.
הפעלה זו יוזמת מפל איתות המביא לדה-פוספורילציה של NFAT, ומפעילה את הטרנסלוקציה הגרעינית שלו.
NFAT נקשר לרכיבי התגובה שלו בגנום, ומניע את ביטוי הלוציפראז.
הוסף מצע ביולומינסנט חדיר לתאים. לוציפראז מחמצן את המצע ומייצר אות.
ירידה בזוהר עם ירידה בריכוז הנוגדנים מאשרת הפעלת תאי T בתיווך נוגדנים ספציפיים לגבעול HA
כדי להעריך את יכולתם של נוגדנים ספציפיים בעלי עניין להתמקד בתאים המבטאים המגלוטינין, החלף את הסופרנטנט של תרביות התאים הנגועות בנגיף ב-25 מיקרוליטר של ציטוטוקסיות תלוית נוגדנים, או ADCC, מדיום בדיקה.
לאחר מכן, בצלחת נפרדת של 96 בארות, בצע דילול פי 4 של הנוגדנים המעניינים במדיום ADCC משולש וטרי החל מ-10 מיקרוגרם למיליליטר לפי הסכמה, והקפיד לכלול את הרקע וללא בקרות נוגדנים.
כאשר כל הנוגדן מדולל, העבירו 25 מיקרוליטר של הנוגדן המדולל לבארות המתאימות בצלחת תא הניסוי והניחו את הצלחת באינקובטור תרבית התאים. לאחר 15 דקות, הוסף 7.5 כפול 10 לתאי האפקטור הרביעי שהשתנה, המבטאים את קולטן ה-Fc המתאים לבאר ב-25 מיקרוליטר של מדיום ADCC לנפח סופי של 75 מיקרוליטר של מדיום ADCC לבאר.
החזר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 6 שעות, והפשיר את מאגר מצע הלוציפראז באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס בשעה האחרונה של הדגירה. כאשר המאגר מוכן, הוסף 75 מיקרוליטר של מאגר מצע לוציפראז לכל הבארות למעט באר בקרת הרקע, וקרא את הצלחת על לומינומטר. לאחר מכן ניתן לחשב את השראת הקיפול של ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלויי נוגדנים בתרביות התאים המועברות או הנגועות.