JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 2:10 דק' • July 8th, 2025
הכן תערובת טרנספקציה על ידי הוספת פולימר קטיוני מתאים ווקטורי פלסמיד נפרדים עבור גנים של נוגדנים בעלי שרשרת כבדה ושרשרת קלה.
הפולימר הטעון חיובית נקשר לפלסמידים הטעונים שלילית ויוצר קומפלקסים.
הוסף את תערובת הטרנספקציה הזו לצלחת מרובת בארות המכילה תרבית תאי כליה עובריים אנושיים במדיום נטול סרום ודגירה.
הקומפלקסים נכנסים לתאים דרך אנדוציטוזיס, גורמים לנפיחות אנדוזומלית וקרע, ומשחררים אותם לציטופלזמה.
הפולימר הקטיוני מייצר נקבוביות בקרום הגרעין, מה שמקל על כניסת וקטור ומאפשר את שעתוקם, ולאחר מכן תרגום לחלבונים כבדים וקלי שרשרת.
חלבונים אלה עוברים לרטיקולום האנדופלזמי, שם חלבונים בעלי שרשרת כבדה וקלה מעומעמים ומקושרים קוולנטית על ידי קשרים דיסולפידים, ויוצרים נוגדנים.
נוגדנים עוברים למנגנון גולגי לשינויים נוספים לאחר התרגום ונארזים בשלפוחיות לשחרור חוץ-תאי.
אסוף את המדיום המכיל את הנוגדנים המשוחררים. הוסף מדיום נטול סרום להמשך ייצור נוגדנים.
הכן את תאי ה-HEK בתוספת DMEM וגדל אותם למפגש של 75% בצלוחיות תרבית של 75 סנטימטר רבוע. עבור כל העברת שרשרת כבדה/קלה, הכינו תערובת עם 1.75 מיליליטר DMEM ללא סרום. כלול 4.5 מיקרוגרם של וקטור שרשרת כבד, 3 מיקרוגרם של וקטור שרשרת קלה ו-50 מיקרוליטר של תמיסת פוליאתילנימין. הוסיפו בעדינות את התערובת הזו לצלחת של תאי HEK וסובבו את התמיסה על הצלחת.
דגרו את הצלחת למשך הלילה, ולאחר מכן התחילו לאסוף את אמצעי התרבות מדי יום, והחליפו אותה במדיום נטול סרום. המדיה מכילה את הנוגדנים, וניתן לאסוף אותה מדי יום במשך ארבעה ימים.