בדיקת הפעלה מלאכותית במבחנה לחקר הפעלת קולטן Fc על ידי נוגדנים

קח השעיה של תאי הרג טבעיים, או NK.

הוסף נוגדנים חד שבטיים נגד CD20 ודגר.

בהיעדר תאי סרטן מטרה המבטאים את אנטיגן CD20, אזור ה-Fc של הנוגדנים נקשר לקולטני FcγRIIIa על פני תא ה-NK.

לאחר הדגירה, הוסף מדיה צוננת. צנטריפוגה והסר נוגדנים לא קשורים.

לאחר מכן, הוסף נוגדנים אנטי אנושיים κ שרשרת קלה. דגירה.

נוגדנים משניים אלה נקשרים לשרשרת הקלה κ של הנוגדנים החד-שבטיים.

קישור הנוגדנים מחקה קשירת אנטיגן מכוונת, ומפעיל מפל איתות תוך תאי.

זה גורם לגירוי מלאכותי של תאי NK בהיעדר תאים סרטניים.

תאי NK מופעלים עוברים סידור מחדש של השלד הציטו-שלד ומשחררים גרגירים ציטוטוקסיים.

יתר על כן, התאים מייצרים כימוקינים וציטוקינים.

לאחר משך הזמן הרצוי, הוסף מדיה מקוררת כדי לעצור את גירוי התאים.

צנטריפוגה את הצינור. אסוף את הסופרנטנט וכדור התא לניתוח במורד הזרם של תפקודי תאי אפקטור NK בתיווך נוגדנים.

יש להוציא 100 מיקרוליטר של תאי הרג טבעיים מרחפים לתוך צינורות של 1.5 מיליליטר או צלחת U עם 96 בארות, ולהניח את התאים על קרח. הכן ריטוקסימאב או נוגדן מעניין אחר בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר.

הוסיפו 1 מיקרוליטר לכל צינור תאים לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם למיליליטר, ודגרו את התאים על הקרח למשך 30 דקות. במהלך הדגירה יש להכין תמיסה של נוגדן שרשרת קלה קאפה אנטי אנושי במדיה בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר. כמות תמיסת הנוגדנים הדרושה תהיה 50 מיקרוליטר לדגימת תא.

יש לחמם את תמיסת הנוגדנים ל-37 מעלות צלזיוס על גוש חום או באמבט מים. לאחר השלמת הדגירה של התאים, הוסף 1 מיליליטר של מדיה קרה כקרח לכל צינור וצנטריפוגה של התאים ב -135 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שוטפים שוב את התאים עם 1 מיליליטר של מדיה קרה כקרח. שאפו את הסופרנטנט לאחר הכביסה האחרונה והוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדני השרשרת הקלה של קאפה אנטי אנושית כדי להפעיל את התאים. הניחו מיד דגימות תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על גוש חום או באמבט מים ודגרו אותן עד לנקודות הזמן הרצויות לניתוח או להליכים אחרים.

הדרך הטובה ביותר לטפל בדגימות מרובות היא להשתמש במתלה צף באמבט מים של 37 מעלות, אותו ניתן להסיר ולהניח על קרח כדי לעצור את כל התגובות באופן מיידי.