בדיקה לזיהוי נוגדנים עצמיים בסרום אנושי באמצעות תרבית עצבית בהיפוקמפוס

קח היפוקמפוס של עובר חולדה.

הוסף טריפסין. דגירה כדי לתווך פירוק מטריצת רקמות, התרופפות תאי ההיפוקמפוס.

לדלל בעזרת חיץ. דגירה להמשך עיכול אנזימטי עם טריפסין.

לאחר מכן, העבירו את מסת הרקמה לצינור המכיל מדיה. פיפטה שוב ושוב לדיסוציאציה מכנית לתאים בודדים.

תאי זרעים על כיסויים מצופים פולי-ליזין בתוך לוחות תרבית.

דגירה. תאי ההיפוקמפוס נצמדים למשטחים המצופים. הנוירונים מפתחים למלה ומרחיבים עצבים קלים.

יתר על כן, הנויריטים גדלים בתהליכים אקסונליים ודנדריטיים, ויוצרים רשת עצבית.

נוירונים בוגרים מבטאים קולטנים מעוררים סינפטיים, קולטני N-Methyl-D-aspartate, או NMDARs.

לאחר הדגירה יש לשטוף את הכיסויים במדיה.

הוסף סרום מדולל לחולי דלקת מוח אוטואימונית. הנוגדנים העצמיים נקשרים ל-NMDARs עצביים.

שוטפים עם מאגר ואז מתקנים את התאים.

הוסף נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור הנקשרים לנוגדנים העצמיים הקשורים ל-NMDAR.

לשטוף עם חיץ. הנח את הכיסוי מעל אמצעי הרכבה המכיל DAPI כדי להכתים גרעינים.

התבוננו מיקרוסקופית באותות פלואורסצנטיים על נוירונים, המעידים על נוכחות של נוגדנים עצמיים בסרום.

לדיסוציאציה אנזימטית של ההיפוקמפוס ב -1 מיליליטר של 2.5% טריפסין בצינור של 50 מיליליטר המכיל את ההיפוקמפוס, לאחר שהבאת הנפח בצינור ל -5 מיליליטר עם HBSS, דגרו את הצינור למשך 15 דקות באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לדלל עוד יותר את הטריפסין, הוסיפו 10 מיליליטר של HBSS שחומם מראש, והחזירו את הצינור לאמבט המים המוגדר על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.

לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי להעביר את ההיפוקמפוס המופיע כמסה רירית לצינור של 50 מיליליטר, ודגרו על הרקמה עם 6 מיליליטר של HBSS מחומם מראש למשך 5 דקות, כפי שהודגם. כדי לנתק את הרקמה באופן מכני, העבירו את מסת ההיפוקמפוס לצינור של 2 מיליליטר עם תחתית חרוטית. לאחר הוספת 1 מיליליטר של מדיית DMEM מחוממת מראש, הומוגניזציה של הגלולה עם מיקרופיפטה של 1,000 מיקרוליטר על ידי שאיבה עדינה למעלה ולמטה.

הקפידו לא ליצור בועות, חזרו על השאיפה למעלה ולמטה 10 עד 20 פעמים בעזרת פיפטת זכוכית שנמשכה מראש, כשקצהו במגע עם החלק התחתון החרוטי של הצינור, עד שהתערובת שקופה. ספרו את התאים לפני שמחלקים אותם באופן שווה על צלחת של 3.5 סנטימטר בתנועות טלטול צולבות. לאחר שתסיים, הניחו את המנה בחממה עם 5% פחמן דו חמצני.

לצביעה חיסונית פלואורסצנטית של תאים במבחנה של 14 יום, הוסף את הדגימה המכילה נוגדנים נגד NMDAR לכיסויים, ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שעה, יש לטפל בדגימה עם פורמלדהיד 4% ב- PBS, כפתרון קיבוע, בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר מכן שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן הוסיפו נוגדנים משניים אנטי-אנושיים Alexa Fluor 488 בדילול של 1 עד 1,000 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרכיבו את הכיסויים המכילים את הדגימה עם מדיום הרכבה נוזלי, ושאבו את כל הנוזל שנותר.