בדיקה לזיהוי נוגדנים עצמיים בסרום אנושי באמצעות תרבית עצבית בהיפוקמפוס

קח היפוקמפוס של עובר חולדה.

הוסף טריפסין. דגירה כדי לתווך פירוק מטריצת רקמות, התרופפות תאי ההיפוקמפוס.

לדלל בעזרת חיץ. דגירה להמשך עיכול אנזימטי עם טריפסין.

לאחר מכן, העבירו את מסת הרקמה לצינור המכיל מדיה. פיפטה שוב ושוב לדיסוציאציה מכנית לתאים בודדים.

תאי זרעים על כיסויים מצופים פולי-ליזין בתוך לוחות תרבית.

דגירה. תאי ההיפוקמפוס נצמדים למשטחים המצופים. הנוירונים מפתחים למלה ומרחיבים עצבים קלים.

יתר על כן, הנויריטים גדלים בתהליכים אקסונליים ודנדריטיים, ויוצרים רשת עצבית.

נוירונים בוגרים מבטאים קולטנים מעוררים סינפטיים, קולטני N-Methyl-D-aspartate, או NMDARs.

לאחר הדגירה יש לשטוף את הכיסויים במדיה.

הוסף סרום מדולל לחולי דלקת מוח אוטואימונית. הנוגדנים העצמיים נקשרים ל-NMDARs עצביים.

שוטפים עם מאגר ואז מתקנים את התאים.

הוסף נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור הנקשרים לנוגדנים העצמיים הקשורים ל-NMDAR.

לשטוף עם חיץ. הנח את הכיסוי מעל אמצעי הרכבה המכיל DAPI כדי להכתים גרעינים.

התבוננו מיקרוסקופית באותות פלואורסצנטיים על נוירונים, המעידים על נוכחות של נוגדנים עצמיים בסרום.

לדיסוציאציה אנזימטית של ההיפוקמפוס ב -1 מיליליטר של 2.5% טריפסין בצינור של 50 מיליליטר המכיל את ההיפוקמפוס, לאחר שהבאת הנפח בצינור ל -5 מיליליטר עם HBSS, דגרו את הצינור למשך 15 דקות באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזי