בדיקה למדידת נוגדן מנטרל titer ספציפי עבור וירוס סינסיטיאלי נשימתי

קח סרום אנושי מדולל סדרתי ומומת חום המכיל נגיף סינציאלי נשימתי או נוגדנים מנטרלים ספציפיים ל-RSV.

הוסף את ההשעיה הוויראלית. הנוגדנים מנטרלים את הנגיפים באופן תלוי דילול.

הכניסו את התערובת לחד-שכבות של תאי אפיתל אנושיים ודגרו לספיחה ויראלית.

זורקים את התערובת. הוסף מדיה המכילה קרבוקסימתיל צלולוז ויוצר כיסוי מוצק למחצה. דגירה.

RSV מנצל את מנגנון התא המארח כדי לסנתז RNA וחלבונים ויראליים, אשר לאחר מכן מתאספים וניצנים כנגיפים בודדים.

תאים נגועים מתים בסופו של דבר. קרבוקסימתיל צלולוז מגביל את תנועת הנגיף, גורם לזיהום מקומי ולמוות של תאים, ויוצר פלאק.

הסר את הכיסוי.

תקן את התאים עם מאגר המכיל אצטון. הציגו חוצץ חוסם המכיל חומר ניקוי כדי לחדור לתאים ולמנוע אינטראקציות נוגדנים לא ספציפיות.

הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבונים נגיפיים.

שכבת נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.

דמיין את הבארות כדי לכמת לוחות פלורסנט.

דילול הסרום הגבוה ביותר המנטרל חמישים אחוז מה-RSV מייצג את טיטר הנטרול.

לפני חיסון תאי A549 ב-RSV, בדוק את לוחית התא תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי חד-שכבות תאי A549 הן 80% מתלכדות. לאחר מכן, הפוך את הצלחת בעדינות כדי להשליך את המדיה, ומחק קלות את הצלחת על מגבת נייר סטרילית וסופגת. לאחר כל שטיפה עם PBS מסוננים וסטריליים.

לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר לבאר של תערובת הווירוס-סרום לבארות המתאימות בצלחת התא A549 בהתאם לתבנית הלוח המסופקת בכתב היד, ודגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. בתום הדגירה השתמשו בפיפטה כדי להסיר 90 מיקרוליטר לבאר, והוסיפו 100 מיקרוליטר מהמדיה המכילה 1X M 199, 1.5% CMC ו-2% FCS ותערובת פניצילין-סטרפטומיצין. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך שלושה ימים.

כדי לתקן ולפתח לוחית בדיקה, הפוך תחילה את לוחית התא A549 הנגועה ב-RSV בעדינות כדי להשליך את המדיה המכילה M 199, CMC, 2% FCS ותערובת פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן, הוסף לאט 200 מיקרוליטר ממאגר הקיבוע לכל באר. דגרו את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, השליכו את מאגר הקיבוע וספגו בעדינות על מגבת נייר סופגת.

השאירו את הצלחת עם הפנים כלפי מטה לייבוש למשך 10 דקות. לאחר מכן, עם מאגר PBS מסונן המכיל 0.05 פוליסורבט-20, צרו תמיסה חוסמת חלב של 5%. הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת החסימה לכל באר, ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בתום הדגירה הופכים את הצלחת בעדינות כדי להשליך את התמיסה, ומכסים על מגבת נייר סופגת.

כדי ליצור את הנוגדן העיקרי, יש לדלל 1 עד 500 נוגדן Goat X RSV בתמיסת החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטר לכל באר, ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים עם פוליסורבט PBS מסונן.

לאחר מכן, הכינו את הנוגדן המשני על ידי דילול של 1 עד 5,000 AlexaFluor Donkey anti-Goat אימונוגלובולין G בתמיסת החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטר לכל באר, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שוטפים את הצלחת חמש פעמים עם פוליסורבט PBS מסונן.

כדי לספור פלאקים עם קורא כתמים אוטומטי, ראשית, השתמש בלוחית תרבית שאינה בשימוש של 96 בארות כדי לכייל את המכשיר על ידי הזנת הגדרות הספירה בערוץ FITC. לאחר מכן, קרא את לוחית התא, עטוף אותה בנייר כסף ואחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בדוק את התמונות של בארות לאיתור פלאקים מלאכותיים או חד-שכבות תאים משובשות, ואל תכלול בארות עם חד-שכבות תאים משובשות.