מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

המטרה הכללית של הניסויים הבאים היא למדוד את התכונות המכניות של הממשק עם גרעין התא ואת הקשר הפיזי שלו עם השלד התאי המקיף אותו. זאת מושג על ידי הפעלת מאמץ מכני על תאים המגודלים על ממברנת סיליקון שקופה ודימוג של העיוותים הגרעיניים המושרים. עיוותים גרעיניים מוגברים תואמים לנוקשות גרעינית מופחתת, מכיוון ששינויים בצימוד שבין הגרעין לשלד התאי עשויים להשפיע אף הם על העיוותים הגרעיניים המושרים.

העברת כוחות תוך-תאיים בין השלד התאי לגרעין נבחנת באופן ישיר על ידי הפעלת מאמץ מקומי על השלד התאי. לאחר מכן, מועבר דימוי של התזוזה של מבני גרעין ושלד תאי המסומנים פלואורסצנטית. התוצאות המתקבלות מציגות את קשיחותם של גרעיני התאים ביחס לשלד התאי המקיף אותם.

בהתבסס על ניסויי מאמץ של התשתית, בדיקת המניפולציה של מיקרו-מחטים חושפת כי שיבוש של הצימוד בין הגרעין לשלד התא גורם לפגמים בהעברת כוחות תוך-תאיים. היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון שאיבה במיקרו-פיפטה של גרעינים מבודדים, הוא שהן מאפשרות מדידות של מכניקת הגרעין בתאים חיים ושלמים מבלי להפר את הארכיטקטורה התאית הרגילה. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי האופן שבו שינויים בהרכב המעטפת הגרעינית יכולים להשפיע על התכונות המכניות של הגרעין.

ניתן להשתמש בהן גם כדי לחקור את תפקיד המכניקה הגרעינית בהקשר של מחלות כגון נוירופתיות LA או סרטן. כל כלי מתיחה מורכב מכלי פלסטיק ללא תחתית שיוצר בהתאמה אישית, בעל קוטר של שלושה אינצ'ים, ומטבע אטם (O-ring) מפלסטיק להחזקת ממבנה סיליקון, המשמש כתשתית לתרבית תאים. להכנת כלי המתיחה, תקפיאו פיסת ממבנה סיליקון בגודל ארבעה אינצ'ים על ארבעה אינצ'ים בין טבעת האטם לבין הכלי, חתכו בזהירות את שאריות הממבנה, שטפו את כלי המתיחה במים דה-יוניים, ולאחר מכן בצעו אוטוקלב לכלי לפני ציפוי ממבנה הסיליקון במולקולות של מטריקס חוץ-תאי; סמנו נקודת ייחוס בחלק החיצוני של הממבנה במרכז התחתון.

סימן ייחוס זה יעזור בזיהוי אותם התאים במהלך ניסויי המתיחה להפעלת מתיחה חד-צירית. שני פסי סרט דבק (scotch tape) מקבילים מודבקים סביב נקודת הייחוס כדי להגביל את היווצרות הממברנה בממד אחד. כדי לספק היצמדות אופטימלית של תאים, גרו את ממברנות הסיליקון עם 3 µg/mL של fibronectin או חלבונים מתאימים אחרים של מטריצה חוץ-תאית.

כסו את צלחת הסינון בעזרת צלחת פוליסטירן הפוכה בקוטר 10 סנטימטרים והדגירו אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שטפו את הממברנה פעם אחת עם PBS כדי להסיר עודפי חלבון. מלאו את הצלחת ב-10 milliliters של מצע גידול והניחו אותה בצד.

לאחר הכנת צלחת ממבקת הסיליקון המצופה, יש לנתק את התאים באמצעות trypsin בריכוז 0.05% ולהזריע תאים דבקים על הצלחת בתוך מצע גידול. הליך זה מודגם באמצעות תאי עוברי עכבר.

מדגרי את הפיברובלסטים או את תאי ה-mes למשך 24 עד 48 שעות בתנאי תרבית רגילים. מיקרוסקופ הפוך המצויד לניסויי מאמץ של תת-מנשוא כולל התקן למתן מאמץ המורכב מלוח בסיס המתחבר לשולחן המיקרוסקופ. הלוח מחזיק פלטה גלילית מרכזית, המשמשת להפעלת מאמץ בחלק המרכזי של ממבנה הסיליקון.

המכשיר כולל גם פלטה נעה המחזיקה את צלחת המתיחה ויכולה להחליק למעלה ולמטה על ארבעה פיני הנחיה, וכן משקולת של five pound להפעלת עומס. כדי להדמיות את הגרעינים, דגרו את התאים בצלחת המתיחה עם 1 µg/mL של צבע hooked למשך 15 דקות ב-37 °C. לאחר הדגירה, שאבו את המצע והחליפו אותו ב-15 mL של מצע גידול ללא phenol red עם 25 mM heis.

לאחר מכן, הברגו את הצלחת לתוך מחזיק הצלחות ומרחו בזהירות גריז להיקף התחתון של ממбраסת הסיליקון כדי להבטיח את החלקתו של הממברנה לאורך הפלטין המרכזי. ודאו שהחלק המרכזי של הממברנה נשאר נקי. הניחו את לוח הבסיס על פלטת שולחן המיקרוסקופ והרכיבו בזהירות את מחזיק הצלחת על לוח הבסיס.

וודאו שבמצב המנוחה הראשוני, ממבנה הסיליקון של צלחית המתיחה מונח באופן רפוי על הפלטינה המרכזית. לאחר מכן, התמקדו בתחתית ממבנה הסיליקון ואתרו את נקודת הייחוס השחורה המרכזית. הנקודה תשמש כנקודת המוצא לכל רכישות התמונות ותסייע באיתור אותם תאים במהלך ואחרי המתיחה.

בתמונה זו, הנקודה המרכזית ממלאת את כל שדה הראייה. החל מהשוליים של הנקודה, כוון את המיקוד כדי לה可ראות את התאים ואת החלק העליון של ממברון הסיליקון. אתר תאים פרוסים היטב עם גרעינים הממוקמים במרכזם.

רכשו תמונת ניגודיות פנים (face contrast), שצריכה להתמקד במתווה התא ובממברנת הסיליקון. לאחר מכן, רכשו תמונת פלואורסצנציה של צביעת ה-nu nuclear hook, שצריכה להתמקד במישור המרכזי של הגרעין. לאחר רכישת תמונות של חמישה עד 15 תאים, חזרו לנקודה המרכזית.

הנח את המשקל באיטיות על כלי המתיחה כדי להשיג הפעלת מאמץ אחידה במרכז הכלי. המאמץ המקסימלי המופעל על התשתית מוגבל על ידי ספייסרי ניילון הממוקמים על פיני היישור האנכיים. לאחר הפעלת המאמץ, התמקד בתחתית ממב冉 הסיליקון ואתר שוב את נקודת הייחוס, והתחל מהנקודה.

העבירו שוב את אותם התאים, וצלמו פעם נוספת תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) ותמונת פלואורסצנציה של הגרעין של כל תא תחת מאמץ מלא, תוך ניסיון להתאים באופן מדויק את מישורי המוקד של התמונות הראשוניות. תהליך זה לא יעלה על 10 דקות כדי למנוע רמיodeling פעיל והסתגלות של התא לתשתית הזרה. לאחר שכל התמונות התואמות נרכשו, החזירו את שולחן המיקרוסקופ לנקודת ההתחלה.

הסר בזהירות את המשקולת מלוח תמיכת הצלחת ואפשר לממברנת הסיליקון להירגע במידת הצורך. דחף בעדינות למעלה את צלחת הסינון עד שתחזור למצב הראשוני. לאחר מכן, קבע את הניגוד הפאזי (phase contrast) והפלואורסצנציה.

תמונות של התאים לאחר המתיחה, כפי שתוארו עבור תמונות המתיחה, תמונות של תאים וגרעינים המסומנים פלואורסצנטית לפני, במהלך ואחרי יישום המתיחה, מנותחות כדי לחשב את המתיחה הגרעינית הנורמלית. בהדגמה זו, נעשה שימוש בסקריפט MATLAB שנכתב במיוחד עבור הניתוח, אך קיימות מספר אפשרויות חלופיות לחישוב מתיחת התשתית המיושמת באופן ידני על ידי התאמת המיקומים של שלוש עד שש נקודות בקרה הממוקמות על הממברנה בין התמונות התואמות של לפני המתיחה ואחרי המתיחה המלאה. תוכנת ה-MATLAB מחשבת לאחר מכן את מתיחת הממברנה המיושמת על ידי השוואת המיקומים של נקודות הבקרה התואמות בין תמונות טרום-המתיחה ותמונות המתיחה המלאה.

המיקומים מושווים גם עבור המאמץ השיורי בין התמונות שלפני המתיחה למשמר התמונות שאחריה. נקודות הבקרה משמשות בו-זמנית לרישום זוגות התמונות, דבר שיסייע בזיהוי תאים פגועים או כאלו המנתקים. לאחר מכן, יש לבחור גרעינים באופן ידני באמצעות תוכנת MATLAB נפרדת המחשבת את המאמץ הגרעיני עבור כל גרעין בנפרד.

דבר זה מושג על ידי התאמת גודל הגרעין בין תמונות פלואורסצנטיות תואמות שלפני המתיחה ואחרי המתיחה, או על ידי התאמת סממנים תוך-גרעיניים כדי לפצות על שינויים קלים במתיחת הממברנה המופעלת בין ניסויים שונים. התוצאות מוצגות כמעוות גרעיני מנורמל. זה מוגדר כיחס בין המעוות הגרעיני המושרה למעוות הממברנה המופעל, שחושב עבור כל גרעין.

ניתן לקבל את סקריפטי ה-MATLAB ממעבדת lambing לפי בקשה. כשלב סופי, כל גרעין עובר תיקוף, ומדידות מתאים שהתנתקו או ניזוקו במהלך הפעלת המתיחה מושמטות. MEFs שהתפשטו על פני שני אזורים נפרדים על ממבנה הסיליקון דוגמו באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לפני, במהלך ואחרי הפעלת מתיחה צירית של 20%UNI; המוצג כאן הוא דוגמה לניסוי מוצלח עם גרעינים תקינים מתאים ששרדו את הפעלת המתיחה ללא נזק או התנתקות.

בניגוד לכך, התאים המוצגים כאן התכווצו או התנתקו באופן חלקי במהלך הפעלת המאמץ, ולכן הם הוחרגו מהניתוח. התא בצד שמאל מראה סימנים של נזק לשלד התא וקריסה גרעינית, בעוד שהתא בצד ימין מתנתק חלקית ומתכווץ במהלך הפעלת המאמץ. דבר זה עשוי להעיד על מאמץ מופרז.

כאן מוצג ניתוח של מאמץ גרעיני מנורמל בלוח של קווי תאי meth שונים של עכברים החסרים Lamin AC, כאשר התאים מבטאים באופן אקטופי וקטור ריק או Lamin A מסוג פרא בהשוואה לתאי meth מאחים מסוג פרא. אובדן הביטוי של חלבוני המעטפת הגרעינית Lamin AC גורם לעלייה במאמץ הגרעיני המנורמל. דבר זה מעיד על ירידה בנוקשות הגרעין, שניתן לשחזרה באופן חלקי או מלא על ידי הכנסה מחדש של Lamin A מסוג פרא. כדי להכין את הניסוי למניפולציה באמצעות מיקרו-מחט, דגרו צלחית תרבית תאים עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר עם ריכוז נמוך של פיברונקטין למשך שעתיים ב-37 °C; לאחר הדגירה, שטפו את הצלחית פעמיים עם HBSS והוסיפו לצלחית 2 מיליליטר של מצע גידול.

לאחר מכן, פיברובלסטים עובריים של עכבר עוברים טריפסינציה עם 0.05% trypsin ונזרעים במצע גידול על גבי צלחת עם תחתית זכוכית מצופה פיברונקטין, בשני מיליליטר של מצע גידול. כדי להשיג תאים בודדים הדבקים שאינם בשלב של התמזגות (non-confluent), החזירו את התאים לאינקובטור למשך הלילה. לצורך צביעת התאים, הוסיפו למצע הגידול צבע מיטוכונדריאלי MitoTracker וצבע גרעיני Hoechst. הוסיפו מצע גידול זה לתאים והמשיכו בדגירה.

בשלב הבא, שטפו את התאים על ידי הדגרה שלהם ב-hank's buffered salt saline למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו לתאים מצע גידול ללא פנול אדום עם 25 millimolar He piece לצורך דימות.

עבור ניסוי המחט המיקרוסקופית (microneedle), הכניסו מחט מיקרוסקופית שנמשכה בעבר אל תוך מניפולטור מיקרוסקופי המחובר למיקרוסקופ הפוך עם מצלמה דיגיטלית מסוג CCD (charge coupled device). מקמו ומקדו את המחט המיקרוסקופית בקרבת תא בודד. רכשו תמונה אחת של התא הבודד ללא החדרת המחט המיקרוסקופית אל תוך השלד התאי (cytoskeleton).

בניגודיות פאזה, תמונה פלואורסצנטית אחת של הווים 3 3, 3 4 2 צבע ותמונה פלואורסצנטית אחת של צבע המיטוכונדריה עם עדשה של 60 x במיקרוסקופ הפוך; באמצעות המיקרו-מניפולטור, הכנס בזהירות את המיקרו-מחט לתוך הציטופלזמה של תא במרחק קבוע מהיקף הגרעין וקח תמונת ניגודיות פאזה אחת, תמונה פלואורסצנטית אחת של הווים 3 3, 3 4, 2 צבע ותמונה פלואורסצנטית אחת של צבע המיטוכונדריה. העבר את המיקרו-מחט מרחק ספציפי לעבר היקף התא במהירות של 1 µm לשנייה, באמצעות מיקרו-מניפולטור המופעל על ידי מחשב, תוך רכישה אוטומטית של תמונות בכל 10 שניות.

בעוד שהמיקרו-מחט נעה למרחק ספציפי לעבר פריפריה של התא, יש לשלוט במיקרו-מניפולטור באמצעות מחשב כדי להשיג מיקרו-מניפולציה עקבית. הפרוצדורות מסתיימות ברכישת תמונות לאחר הסרת המיקרו-מחט מהשלד התאי; תמונות של מאפיינים המסומנים פלואורסצנטית של הגרעין והשלד התאי, שנרכשו לפני, במהלך ולאחר מניפולציית המיקרו-מחט, מנותחות כדי לחשב את ההעתקה של אזורים תוך-תאיים קטנים. בהדגמה זו, נעשה שימוש בסקריפט MATLAB שנכתב במיוחד לצורך הניתוח, אך קיימות מספר אפשרויות אחרות.

ניתן להשיג את סקריפט ה-MATLAB ממעבדת lambing על פי בקשה, לצורך מדידת העתק המיוצר על ידי המיקרו-מחט. תוכנת ה-MATLAB משתמשת באלגוריתם של מתאם הצלבה מנורמל (normalized cross correlation) כדי לחשב את ההיסט בין המיקום המקורי של התכונות המסומנות פלואורסצנטית לבין מיקומן הזוהה מחדש. ההעתקים מוצגים לאחר מכן כמפות וקטוריות ונשמרים כערכים מספריים.

השלב הבא הוא להשתמש במפות וקטורי ההעתקה שהתקבלו כדי לקבוע את ההעתקות הממוצעות בתוך השלד התאי או הגרעין באמצעות matlab. ראשית, בחר שלוש נקודות או יותר בתוך השלד התאי באתר יישום המאמץ. במפת וקטורי ההעתקה, חשב את הערך המספרי הממוצע כדי לקבוע את מידת המאמץ בשלד התאי ליד אתר היישום שנוצר במהלך יישום המיקרו-מחט.

בשלב הבא, בחרו שלוש נקודות או יותר בתוך הגרעין, בסמיכות לאתר הפעלת המאמץ, וחשבו את ערך הממוצע. ערך זה מייצג את מידת המאמץ הגרעיני בקרבת אתר הפעלת המיקרו-מחט. באותה שיטה, קבעו את המאמץ הגרעיני ואת המאמץ של השלד התאי הרחוקים מאתר הפעלת המאמץ, באמצעות נקודות שנבחרו באזורים אלה בהתאמה.

נערך ניסוי מניפולציה באמצעות מחט מיקרוסקופית (microneedle) כדי למדוד העברת כוחות תוך-תאיים. מוצגים כאן תמונות בניגודיות פאזה (phase contrast) ותמונות פלואורסצנציה של פיברובלסט המסומן בצבע גרעין כחול ובצבע מיטוכונדריאלי MIT tracker green. מחט מיקרוסקופית הוכנסה לתוך השלד התאי במרחק מוגדר מהגרעין, ולאחר מכן הוזזה לכיוון פריפריה התא.

מיקום המיטוכונדריה נמדד לפני, במהלך ואחרי מאמץ של השלד התאי, ולאחר מכן המעקשיםKושרטו כווקטורים. כל וקטור מייצג את ההעתקה שחושבה כהפרש בין המיקום המקורי למיקום החדש שזוהה. אזורים עם עוצמת תמונה נמוכה או מרקם שאינו מספיק הוצאו מהניתוח.

לאחר מכן כמתה את ההעתקה של השלד התאי והגרעין באזורים נבחרים במרחקים גוברים מאתר הפעלת המתיחה, הן עבור פיברובלסטים של הביקורת והן עבור פיברובלסטים. בתאים עם צימוד גרעין-שלד תאי תקין, כוחות מועברים דרך התא כולו, מה שמוביל לעיוות גרעיני ושלדי מושרה שנחלש בהדרגה ככל שהמרחק מאתר הפעלת המתיחה גדל. לעומת זאת, תאים עם צימוד גרעין-שלד תאי משובש מראים העתקה מקומית בקרבת אתר ההפעלה ורק עיוות מושרה מועט במרחקים גדולים יותר.

נצפתה הפעלת מאמץ ציטושלבי דומה באתר החדרת המיקרו-מחט הן עבור פיברובלסטים של ביקורת והן עבור פיברובלסטים עם צימוד גרעין-שלד תא משובש. עם זאת, תזוזות גרעיניות וציטושלביות שהושרות באזורים אחרים היו קטנות משמעותית בפיברובלסטים עם צימוד גרעין-שלד תא משובש מאשר בתאי ביקורת. לפיכך, ירידה בתזוזה הציטושלבית והגרעינית הרחק מאתר הפעלת המאמץ מעידה על כך שההעברה הכפויה בין שלד התא לגרעין הופרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן מדידת מכניקה גרעינית והעברת כוחות תוך-תאיים בין הגרעין לשלד התא. תוכלו להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות בחלבוני מעטפת הגרעין או שינויים בהרכב מעטפת הגרעין המתרחשים במהלך ההתפתחות או בסרטן.