טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים

קח עמודת כרומטוגרפיה של זיקה המכילה חרוזי אגרוז מצומדים לחלבון A, חלבון קושר נוגדנים.

הוסף מאגר מחייב עם pH ניטרלי כדי לאזן את העמודה.

טען את התרבית מתרבית תאים המייצרת נוגדנים, המכילה נוגדנים חד שבטיים וחלבונים תאיים מזהמים.

ה-pH הנייטרלי מקל על קשירת חלבון A לאזור ה-Fc של הנוגדנים בזמן שהמזהמים זורמים דרכו.

מדוד את ספיגת ה-UV של הזרימה כדי ליצור כרומטוגרמה. ספיגה גבוהה במהלך טעינת הדגימה מצביעה על חלבונים לא קשורים בזרימה.

שטפו את העמודה עם מאגר הכריכה כדי להסיר מזהמים שאינם קשורים במיוחד.

הוסף חוצץ פליטה עם pH נמוך כדי לשבש את האינטראקציה בין חלבון A לנוגדנים. אסוף את הנוגדנים שנפלטו על ידי ניטור שיא הספיגה.

לנטרל את ה-pH כדי למנוע פירוק נוגדנים והעברה למסנן צנטריפוגלי.

צנטריפוגה כדי לרכז את הנוגדנים ולהשעות מחדש במאגר לבדיקות במורד הזרם.

לאחר הכנת מאגרים ואתחול מערכת FPLC על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בעורך השיטות כדי להגדיר את שלבי ההפעלה באופן הבא. אזן את המערכת עם חמישה אמצעי אחסון של עמודות או CV של מאגר כריכה.

טען את הדגימה על העמודה ואסוף את זרימת הדגימה דרכה, ולאחר מכן השתמש בחמישה CV של מאגר מחייב כדי לשטוף את המערכת. השתמש בחמישה CV של מאגר פליטה כדי לחסל את העמודה באמצעות פיצול איזוקרטי. ולאסוף את דגימות הנוגדנים המטוהרות כשברים באמצעות אספן השברים.

לבסוף, אזנו את המערכת עם חמישה CV של מאגר מחייב ואספו את הזרימה דרך מיכל פסולת. לאחר השלמת הגדרת השיטה, ציין את עוצמת הקול של המדיום המותנה שיש להחיל על העמודה ושמור את השיטה.

לאחר מכן, טבלו את צינור משאבת הדגימה לתוך הכלי המכיל את המדיום המותנה. לאחר מכן, הכן מיכל נפרד לאיסוף זרימת הדגימה דרך צינור היציאה שצוין. הכנס צינורות איסוף לקולט השברים והוסף מאגר נטרול לכל צינור איסוף. במודול בקרת המערכת של התוכנה, פתח את השיטה לשימוש. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל את הריצה.

לאחר השלמת הטיהור ומודול ההערכה, בדוק את הכרומטוגרמה המתקבלת. שלב את כל השברים המכילים חלבון לצינור, ולאחר מכן השתמש ב-PBS ובמכשיר סינון צנטריפוגלי עם חתך של 30 קילודלטון כדי לרכז את הדגימה ולבצע חילופי חיץ. לבסוף, השתמש בבדיקת BCA כדי למדוד את ריכוז הנוגדנים בהתאם להוראות היצרן.