טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית לזיהוי נוירוגנזה של היפוקמפוס בוגר

קחו קטע מוח של עכברים המורכב מפיתול ההיפוקמפוס המשונן, אתר לנוירוגנזה המורכב מאבות עצביים בשלבי התמיינות מובחנים.

העבר את הקטע לתמיסה חוסמת חדירה. מולקולות דטרגנט בתמיסה מחלחלות לתאים, בעוד החלבונים חוסמים את אתרי הקישור הלא ספציפיים.

הוסף קוקטייל נוגדנים ראשוני המכוון לסמני נוירוגנזה ספציפיים, חלבון הקשור למיקרו-צינוריות וחלבון נימה

ביניים.

הסר את הנוגדנים הלא קשורים. להציג נוגדנים משניים שונים המסומנים בפלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

הוסף חלבוני סרום מאותו מארח כמו אחד הנוגדנים העיקריים, והרווי את הפרטופים על הנוגדנים המשניים.

הציגו שברי Fab חד-ערכיים הרווים את האפיטופים של חלבוני הסרום, ומונעים קשירה לא ספציפית.

הוסף נוגדן ראשוני שני שגדל על ידי אותו מארח, ונקשר לחלבון נימה ביניים אחר.

הציגו נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים השני.

באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, זהה את תת-סוגי האב העצביים המבטאים שילובי סמנים ייחודיים.

התחל בהעברת החלקים מתמיסת נוזל הקפאה ל- TBS בעזרת מברשת עדינה. שטפו היטב את החלקים, החל משטיפת לילה בחום של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חמש שטיפות של 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע את כל הדגירות הללו בתסיסה עדינה מתמשכת.

אם אחד האנטיגנים המעניינים הוא אנלוגי תימידין, יש ליישם שלב דנטורציה של חומצה הידרוכלורית בשלב זה, ואחריו שלב נטרול במאגר בוראט. המשך עם חדירה וחסימה של אתרי קשירת הנוגדנים הלא ספציפיים ב-TBS-plus. תן לדגירה זו להימשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, דגרו בנוגדנים הראשוניים הראשוניים הראשוניים הראשוניים המדוללים ב-TBS-plus למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את החלקים שלוש פעמים ב-TBS, ופעם אחת ב-TBS-T. הניחו לכל אמבטיה למשך 10 דקות. לאחר מכן, דגרו בנוגדנים משניים מצומדים פלואורוכרום ראשונים למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. מעתה והלאה, הגן על החלקים מפני חשיפה לאור.

לאחר סדרת שטיפה נוספת, העבירו את החלקים לתמיסת סרום של 10% ממין מארח שממנה נוצרו שני הנוגדנים העיקריים. דגרו את החלקים בתמיסה זו למשך שלוש שעות כדי להרוות את הפרטופים הפתוחים על הנוגדן המשני הראשון. מאוחר יותר, שטפו שלוש פעמים ב-TBS, ופעם אחת ב-TBS-T כדי להסיר את הסרום.

לאחר מכן, הכינו תמיסה של TBS-plus עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של שברי Fab חד-ערכיים לא מצומדים המכוונים כנגד המין המארח של הנוגדן הראשוני. זה מכסה את האפיטופים שאחרת ניתן היה לזהות על ידי הנוגדן המשני השני. מעבירים את החלקים לתמיסה זו ודוגרים למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקים לפחות שלוש פעמים ב- TBS, ופעם אחת ב- TBS-T. במהלך ההעברות, ספוג את תוספות הרשת המכילות את החלקים על מגבת נייר כדי להסיר שאריות Fab. כעת, דגרו את החלקים בנוגדנים העיקריים השני למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר סדרת שטיפה נוספת, יש למרוח את הנוגדן המשני השני למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החלקים שלוש פעמים ב- TBS והמשיכו בהרכבת החלקים בג'לטין. יבש את השקופיות באוויר והחלק אותן באמצעות מדיום הרכבה נגד דהייה.