טכניקת צביעת איברים שלמים להדמייה תלת מימדית של הכליה

קח כליית עכבר קבועה. שומנים ברקמה גורמים לפיזור אור, ופיגמנטים גורמים לספיגת אור, מה שהופך את התאים לאטומים.

טפל ברקמה עם CUBIC-L להסרת שומנים והסרת צבע. אמינו אלכוהול ב-CUBIC-L מסיר ליפידים ופיגמנטים, ממזער את פיזור האור ומגביר את השקיפות.

מולקולות דטרגנט ב-CUBIC-L מחלחלות גם לתאים.

הציגו קוקטייל נוגדנים ראשוני הנקשר לטירוזין הידרוקסילאז ציטופלזמי בתאי עצב של העצבים הסימפתטיים ואקטין שריר חלק אלפא בתאי שריר חלק בכלי הדם.

הוסף נוגדנים משניים המסומנים בפלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

בצע לאחר קיבוע רקמות כדי לשמר את הטיפול בנוגדנים.

טבלו את הרקמה ב-CUBIC-R+ שמחליף מים ומתאים את מקדם השבירה של חלבונים, מה שממזער עוד יותר את פיזור האור ומגביר את השקיפות.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור, יריעות אור מאירות את הרקמה ומעוררות את הפלואורופורים.

ללכוד את האור הנפלט מהפלואורופור ולשחזר תמונה תלת מימדית, המציגה את התפלגות העצבים הסימפתטיים סביב העורקים בכליה.

כדי להתחיל, בצע את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלוף ודגימת הכליה על ידי טבילת הכליה ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. יש לתת שלוש שטיפות באמצעות PBS למשך שעתיים כל אחת. בצע את תהליך הסרת הצבע והסרת השומנים על ידי טבילת הכליה הקבועה בשבעה מיליליטר של 50% CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.

לאחר שש שעות, טבלו את הכליה בשבעה מיליליטר של CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מילימטר עם ניעור עדין ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. רעננו את CUBIC-L מדי יום. לאחר השלמת הסרת הצבע והסרת השומן, השתמש בכף חלוקה לטיפול בדגימה, ושטוף את הכליה שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

צביעה חיסונית של הכליה נטולת השומנים בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חיץ מכתים עם ניעור עדין בשייקר אינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים. לאחר מכן, שטפו את הכליה עם 0.5% Triton X-100 ב-PBS, הידוע גם בשם PBST, בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. עבור צביעת נוגדנים משנית, טפל בכליה עם נוגדנים משניים במאגר הצביעה בחושך עם ניעור עדין ב-37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים. תקן את הצביעה בשטיפת PBST בטמפרטורת החדר למשך יום אחד.

לאחר הקיבוע, טבלו את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB למשך שלוש שעות ושטפו אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שש שעות. בצע את התאמת מקדם השבירה על ידי טבילת הכליה בשבעה מיליליטר של 50% CUBIC-R+ בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר עם ניעור למשך יום אחד, ולאחר מכן טיפול בשבעה מיליליטר CUBIC-R+ עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך יומיים.