בדיקת אימונופלואורסנציה לאיתור אגרגטים אלפא-סינוקלאין בקטע ביופסיה של העור

קח את ההקפאה של ביופסיית עור מחולה פרקינסון עטוף במדיום הטבעה.

הרקמה מורכבת מהאפידרמיס החיצוני ביותר, דרמיס בסיסי ושומן תת עורי המועצב על ידי עצבים.

שטפו את החלק כדי להסיר את מדיום ההטבעה. מעבירים אותו לתמיסה חוסמת חדירה, מחלחלת לתאים וחוסמת אתרי קישור לא ספציפיים.

טבלו את החלק בקוקטייל נוגדנים ראשוני כדי להשיג תיוג נוגדנים אחיד, המכונה צביעה צפה חופשית.

הנוגדנים נכנסים לתאי העצב ונקשרים לצברי אלפא-סינוקלאין המפוזרים לאורך האקסונים - צורה מצטברת האופיינית למחלות ניווניות של מערכת העצבים - והידרולאזות קרבוקסיל-טרמינליות.

הכנס נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

טפל בצבע קושר DNA פלואורסצנטי שמכתים את הגרעין.

הניחו את הרקמה על שקופית, מרחו מדיום הרכבה ואטמו בעזרת כיסוי.

תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, הקרינה משני הנוגדנים חושפת נוכחות של אגרגטים אלפא-סינוקלאין לאורך האקסונים של נוירונים עוריים.

כדי להתחיל, מלאו חלק מהבארות של צלחת טרייה של 96 בארות ב -100 מיקרוליטר תמיסת כביסה. העבירו את החלקים שיש לנתח מצלחת האחסון לזו המכילה את תמיסת הכביסה. השאירו את החלקים בתמיסת הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו כל חלק לבאר ריקה המכילה את אותה תמיסת כביסה, וחזרו על הכביסה. לאחר מכן, הוסף תמיסת כביסה לחלקים, והעביר אותם לבארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות לפחות ומקסימום 4 שעות.

לדלל את הנוגדנים העיקריים, אנטי-PGP9.5 ואנטי-5G4 בתמיסת העבודה. מעבירים את החלקים לבארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הנוגדנים העיקריים ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

למחרת יש לשטוף את החלקים בבארות המכילות תמיסת כביסה כמתואר קודם לכן. לדלל את הנוגדנים המשניים - עז נגד ארנב לאיתור אנטי-PGP9.5 ואנטי-עכבר עז לאיתור 5G4 בתמיסת העבודה.

העבירו את החלקים השטופים לבארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הנוגדנים המשניים. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של פלואורופור מצומד עם נוגדנים משניים, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות.

לאחר מכן, יש לשטוף את החלקים פעמיים בתמיסת כביסה כמתואר קודם לכן. העבירו את החלקים השטופים לבארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטר DAPI למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את החלקים פעמיים בתמיסת כביסה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, הרכיב את החלקים על שקופית במצב הנכון, הימנע מקיפול שגוי.

הוסף כמה טיפות של מדיום הרכבה לשקופית וכסה את החלק בכיסוי. תן למגלשות להתייבש למשך הלילה. למחרת, אחסנו את המגלשות בקופסה מתאימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והקפידו להימנע מחשיפה לאור.

בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או מיקרוסקופ קונפוקלי, צפה בקטעים. רכוש את התמונות על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לנתח אותות חיוביים בקטעים, מבחינת התפלגות מרחבית ועוצמת האות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.