JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:15 דק' • July 8th, 2025
קח מערך פפטידים שמקורו באנטיגן לויקוציטים אנושיים של תורם איברים או מרצף HLA המורכב מפפטידים שונים על קרום התאית.
כל פפטיד נושא לפחות אי התאמה אחת של חומצת אמינו בין רצף ה-HLA של התורם למקבל, המייצג אפיטופ פוטנציאלי לדחיית איברים בתיווך נוגדנים.
טפל עם חוצץ חוסם כדי למנוע אינטראקציה לא ספציפית של נוגדנים.
הוסף נסיוב נמען שנאסף לאחר השתלת איברים, המכיל נוגדנים אלולוגיים.
נוגדנים אלה, שנוצרו כנגד ה-HLA של התורם, נקשרים לאפיטופ המטרה שלהם.
הוסף נוגדן משני מצומד פרוקסידאז שנקשר לאלונוגדן.
הוסף מצע כימילומינסנט ומי חמצן. הפרוקסידאז משתמש במי חמצן כדי לחמצן את המצע, ופולט אור.
סרוק את הממברנה כדי לקבל תמונה.
הוסף חיץ כדי להסיר את הנוגדנים הקשורים. בדוק עם נסיוב מקבל ההשתלה לפני ההשתלה וקבל תמונה.
בהשוואה לתמונה שלפני ההשתלה, כתמים כהים בתמונה שלאחר ההשתלה מצביעים על אפיטופים של HLA ספציפיים לתורם המעוררים תגובתיות של נוגדנים.
לאחר סינתזה של המערכים, חסום את הממברנות עם 20 מיליליטר של חלב דל שומן 5% מומס בתמיסת מלח עם טריס עם 0.1% טווין 20 או TBST לתקופת הדגירה המתאימה עם נדנדה. לאחר מכן, שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם 20 מיליליטר TBST טרי למשך 5 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן דגירה עם 20 מיקרוליטר של סרום נמען גולמי בחלב 2.5% ב-TBST למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה ולדגור את הממברנות עם נוגדן IgG מצומד פרוקסידאז אנטי אנושי של חזרת עיזים למשך שעתיים.
הסר את הנוגדן המשני הלא קשור בשלוש שטיפות של 10 דקות ב-TBST, ופתח את הממברנות ב-5 מיליליטר של תמיסת לומינול טרייה שהוכנה בתוספת 5 מיליליטר של תמיסת מי חמצן. לאחר דקה אחת, דמיין את אותות הכימילומינסנציה המשופרים על מצלמת מתאימה.
לאחר שמירת התמונות שפותחו, דגרו את הממברנות עם 20 מיליליטר של מאגר הפשטה מסחרי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ולאחר מכן שלוש שטיפות של 10 דקות ב-TBST. לאחר מכן חסום, שחזר ודמיין את הממברנות כפי שהודגם זה עתה עם דגימת סרום מאותו מטופל שהתקבלה בנקודת זמן אחרת.
This article describes a method for identifying donor-specific HLA epitopes that may lead to antibody-mediated organ rejection post-transplantation. The technique utilizes peptide arrays derived from HLA sequences to detect alloantibodies in recipient serum.
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026