זיהוי מבוסס פפטיד של אלונוגדנים HLA נגד תורמים אצל מושתלי איברים

קח מערך פפטידים שמקורו באנטיגן לויקוציטים אנושיים של תורם איברים או מרצף HLA המורכב מפפטידים שונים על קרום התאית.

כל פפטיד נושא לפחות אי התאמה אחת של חומצת אמינו בין רצף ה-HLA של התורם למקבל, המייצג אפיטופ פוטנציאלי לדחיית איברים בתיווך נוגדנים.

טפל עם חוצץ חוסם כדי למנוע אינטראקציה לא ספציפית של נוגדנים.

הוסף נסיוב נמען שנאסף לאחר השתלת איברים, המכיל נוגדנים אלולוגיים.

נוגדנים אלה, שנוצרו כנגד ה-HLA של התורם, נקשרים לאפיטופ המטרה שלהם.

הוסף נוגדן משני מצומד פרוקסידאז שנקשר לאלונוגדן.

הוסף מצע כימילומינסנט ומי חמצן. הפרוקסידאז משתמש במי חמצן כדי לחמצן את המצע, ופולט אור.

סרוק את הממברנה כדי לקבל תמונה.

הוסף חיץ כדי להסיר את הנוגדנים הקשורים. בדוק עם נסיוב מקבל ההשתלה לפני ההשתלה וקבל תמונה.

בהשוואה לתמונה שלפני ההשתלה, כתמים כהים בתמונה שלאחר ההשתלה מצביעים על אפיטופים של HLA ספציפיים לתורם המעוררים תגובתיות של נוגדנים.

לאחר סינתזה של המערכים, חסום את הממברנות עם 20 מיליליטר של חלב דל שומן 5% מומס בתמיסת מלח עם טריס עם 0.1% טווין 20 או TBST לתקופת הדגירה המתאימה עם נדנדה. לאחר מכן, שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם 20 מיליליטר TBST טרי למשך 5 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן דגירה עם 20 מיקרוליטר של סרום נמען גולמי בחלב 2.5% ב-TBST למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה יש לשטוף