איתור נוגדנים אנטי-גליקניים במחזור הדם עם מערך גליקן מודפס

התחל עם גליקוצ'יפ פונקציונלי הכולל תת-מערכי גליקן מודפסים המאורגנים בבלוקים של מערכים.

כל נקודה בתת-המערך מייצגת גליקן מובהק - פולימר מבוסס פחמימות עם שינויים בהרכב החד-סוכר, אורך השרשרת ודפוס ההסתעפות.

טפל בגליקוצ'יפ עם מאגר חוסם כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים.

העבירו את הגליקוצ'יפ והכניסו סרום עכבר מדולל למאגר בתוספת פעילי שטח כדי למזער את צבירת הנוגדנים. דגירה תחת תסיסה.

תסיסה מקדמת פיזור אחיד של הסרום, ומאפשרת קשירה סלקטיבית של נוגדנים אנטי-גליקנים לגליקנים ספציפיים על סמך מאפיינים מולקולריים מובחנים.

שטפו עם ריכוזים הולכים ופוחתים של חוצץ המכיל חומר פעילי שטח כדי להפריע לקשירה ולשטיפה לא ספציפית.

כיסו את הגליקוצ'יפ בנוגדנים משניים מצומדים לביוטין נגד עכברים, באינטראקציה עם נוגדנים אנטי-גליקניים קשורים מראש ושטפו.

הציגו סטרפטווידין עם תווית פלואורופור, הנקשרים לנוגדנים משניים ביוטיניליים. שוטפים ומסירים עודפי תמיסה.

סרוק את הגליקוצ'יפ ובדוק אם יש כתמי פלואורסצנטיות מובהקים במיקומים שונים המרמזים על נוגדנים במחזור ספציפיים לגליקן בסרום.

הכן את המאגר #1 דרך מאגר #4 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. להכנת הגליקוצ'יפס והדגימות, הניחו את קופסת האחסון עם השקופיות על השולחן עד שהם מגיעים לטמפרטורת החדר. פתח את הקופסה והעביר את הגליקוצ'יפ לתא הדגירה, אותו יש כבר להתמזג בנייר סינון רטוב כדי לשמור על הלחות קבועה בתוך החדר.

בינתיים, יש לדלל את סרום העכברים עם חיץ 1 בצינורות של 1.5 מיליליטר. הומוגניזציה של תמיסת הסרום למשך 5 שניות בעזרת מערבל מערבולת. לאחר ההומוגניזציה, דגרו את הסרום המדולל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט מים כדי למנוע הצטברות אימונוגלובולין. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות למשך 3 דקות ב -10,000 פעמים גרם ו -25 מעלות צלזיוס.

אסוף את הסופרנטנט והשליך כל חומר משקע. הנח את הגליקושב בזהירות בתא הדגירה. דגרו אותו עם 1 מיליליטר של מאגר #3 כדי לחסל כל חומר שיורי על פני הגליקושב. במשך 15 דקות, בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, החזיקו את הגליקושביפ במצב אנכי, ושטפו אותו מחדש עם כמה טיפות של בופר #3 באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק.

לאחר מכן, הסר בזהירות את המאגר ממשטח הגליקוצ'יפ באמצעות נייר פילטר. הנח את הגליקוצ'יפ בחזרה לתא הדגירה. מורחים את דגימת הסרום המדוללת על פני הגליקוצ'יפ באמצעות מיקרופיפטה. ודא שכל האזורים היבשים של משטח הגליקוצ'יפ מכוסים על ידי דגימת הסרום המדוללת באמצעות קצה הפיפטה.

דגירה עם תסיסה מסלולית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. לאחר הדגירה, הסר את כל הדגימה העודפת וטבול את הגליקושב למשך 5 דקות במאגר #3 בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. העבירו את הגליקוצ'יפ למיכל עם מאגר #4, ולבסוף, שטפו את הגליקוצ'יפ במים טהורים במיוחד.

צנטריפוגה את הגליקוצ'יפ למשך דקה אחת ב -175 פעמים גרם ו -25 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הנוזל. לאחר החזרת הגליקוצ'יפ לתא הדגירה, מורחים תמיסה של אנטי-עכבר עז מצומד לביוטין על פני הגליקוצ'יפ. דגירה עם תסיסה מסלולית ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. הסר את השבר הלא קשור וחזור על שלבי הכביסה.

לאחר צנטריפוגה, דגרו את הגליקוצ'יפ בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות עם 2 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת הסטרפטווידין המתאימה המסומנת על ידי פלואורוכרום במאגר #2. לאחר עבודה בחושך להסרת השבר הלא קשור וחזרה על שלבי הכביסה, יבש את הגליקוצ'יפ באוויר.

כדי לסרוק את המערך, השאירו את הגליקוצ'יפ על השולחן עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר בחושך. במקביל, הפעל את סורק השקופיות ואת הלייזר. החזק את המיקרו-מערך, החלק את הגליקושב לתוך החריץ עד שהוא נוגע בגב. סרוק את הגליקושב על ידי הפעלת Easy Scan, ושמור את הסריקה כקובץ .tiff.