JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:38 דק' • July 8th, 2025
קח שקופית עם בארות תגובה המכילות חלקים דקים של רקמות צמחים שונות. הרקמות מקובעות ומוטבעות בתוך שרף לצביעה חיסונית.
הנח את המגלשה בתוך תא דגירה חשוך ולח כדי למנוע חשיפה לאור ואידוי מגיב במהלך השלבים הבאים.
הציגו תמיסת חסימה למניעת אינטראקציה לא ספציפית של נוגדנים.
שטפו כדי להסיר תמיסת חסימה עודפת, ולאחר מכן הוסיפו נוגדנים ראשוניים ספציפיים לאנטיגן ודגרו.
הנוגדנים נקשרים לאנטיגנים היעד שלהם, כלומר חלבוני ארבינוגלקטן ופקטינים בדופן התא.
הכנס נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.
שטפו כדי להסיר את הנוגדנים הלא קשורים, ומרחו צבע פלואורסצנטי שנקשר לתאית, ומסמן את דופן התא.
הוסף אמצעי הרכבה ואטום עם כיסוי.
תחת מיקרוסקופ, פלואורסצנטיות מהצבע והנוגדנים הקשורים מסייעים בהדמיית תאית בדפנות תאי הצמח המשולבים עם חלבוני ארבינו-גלקטן או פקטין, ומציגים את התפלגותם הספציפית לרקמה.
כדי להכין תא דגירה לשקופיות התגובה, הניחו כמה מגבות נייר לחות, בתחתית קופסת קצות פיפטה ועטפו את הקופסה בנייר אלומיניום. העבירו את השקופיות מהקופסה לתא הדגירה. פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל באר. לאחר דגירה של המגלשה למשך 10 דקות, הסר את תמיסת החסימה. לאחר מכן, שטפו את כל הבארות פעמיים עם PBS למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר הכנת תמיסות הנוגדנים העיקריות כמתואר בכתב היד, בצע שטיפה אחרונה של הבארות במים מזוקקים ונטולי יונים למשך 5 דקות.
פיפטה את תמיסת הנוגדנים העיקרית לבארות התגובה. לאחר מכן, פיפטה את תמיסת החסימה לבארות הבקרה. סגור את תא הדגירה. הניחו לו לעמוד שעתיים בטמפרטורת החדר, ואז מקררים אותו למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס. הכן תמיסה של 1% של הנוגדן המשני בתמיסת חסימה. יהיה צורך בכ-40 מיקרוליטר לבאר.
מכסים את התמיסה בנייר אלומיניום. שטפו את בארות מגלשת התגובה פעמיים עם PBS, ופעם אחת עם מים מזוקקים ונטולי יונים למשך 10 דקות בכל פעם. ודא שלא יישארו תמיסת חסימה או משקעים בבארות. פיפטה את תמיסת הנוגדנים המשנית לכל הבארות. דגרו את המגלשות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
שוב, שטפו את בארות מגלשת התגובה פעמיים עם PBS, ופעם אחת במים מזוקקים ונטולי יונים. לאחר מכן הוסף טיפה של calcofluor-white לכל באר. מבלי לשטוף, הוסיפו טיפה של אמצעי הרכבה לכל באר, וכסו כל באר בכיסוי. התבונן בקטעי הדגימה בשקופית התגובה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
עבור כל תצפית, השתמש במסנן UV כדי לזהות דפנות תאים מוכתמות על ידי הקלקופלואור ומסנן FITC כדי לזהות אימונולוקליזציה. להדמיה טובה יותר של התוצאות, השתמש ב-ImageJ או בתוכנית ניתוח תמונות דומה כדי למזג כל תמונת מסנן UV עם תמונת המסנן FITC המתאימה.