שימוש בכריך ELISA כדי לקבוע את תכולת הגליקופרוטאין האימונוגני בחיסון

התחל עם צלחת בדיקה פסיבית המצופה בנוגדנים חד שבטיים אימונוגניים ספציפיים לגליקופרוטאין כלבת וחומר חוסם למניעת אינטראקציות לא ספציפיות.

הציגו התייחסות מדוללת סדרתית ובדקו חיסוני כלבת עם תכולת גליקופרוטאין פוחתת. אטום את הצלחת כדי למנוע זיהום.

במהלך הדגירה, גליקופרוטאינים אימונוגניים מקיימים אינטראקציה עם נוגדנים חד שבטיים מצופים דרך אתר אנטיגני ספציפי.

לאחר הדגירה, הסר את הסרט, שאב את הסופרנטנט ושטוף את הצלחת.

על גבי נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לגליקופרוטאין מצומדים לאנזים הנקשרים לאתר אנטיגני אחר על הגליקופרוטאין, ויוצרים קומפלקס חיסוני.

הוסף תמיסה המכילה מצע וכרומגן. כאשר המצע מקיים אינטראקציה עם האנזים, הוא גורם לחמצון הכרומוגן, ומשנה את צבע התמיסה.

הוסף תמיסת עצירה כדי לנטרל את האנזימים.

מדוד את הספיגה וצור עקומת ייחוס באמצעות ערכי חיסון הייחוס.

זהה את האזור שבו יש קשר ליניארי בין הספיגה לתכולת הגליקופרוטאין של דילול חיסון הייחוס. לאחר מכן, אקסטרפולציה של תכולת הגליקופרוטאין של דילול חיסון הבדיקה על סמך הספיגה הנופלת באזור זה.

כדי לשטוף את הלהב, הוסף 300 מיקרוליטר ממאגר הכביסה לכל באר. לאחר מכן, שאפו בזהירות והעבירו את תכולת הבאר לנמען המכיל תמיסה של 2.6% נתרן היפוכלוריט. חזור על תהליך כביסה זה חמש פעמים נוספות כדי לשטוף בהרחבה את הצלחת הרגישה.

לאחר מכן, הפוך את המיקרופלייט ותן לו להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה. להרכיב מחדש את חיסון הייחוס במיליליטר אחד של מים מזוקקים כך שהריכוז הסופי של גליקופרוטאין נגיף הכלבת הוא 10 מיקרוגרם למיליליטר. הכן דילול פי 10 של חיסון הייחוס המחודש בדילול כדי להגיע לריכוז גליקופרוטאין של נגיף הכלבת של מיקרוגרם אחד למיליליטר.

לאחר מכן, בצע שישה דילולים כפולים סדרתיים של חיסון ייחוס זה בדילול כמתואר בטבלה הראשונה של פרוטוקול הטקסט. הפץ 200 מיקרוליטר של המדלל בבארות כפולות כדי לשמש כבקרה ריקה, ו-200 מיקרוליטר לבאר עבור כל דילול חיסון ייחוס בשכפול.

לאחר מכן, הכינו דילול פי 10 של החיסון שנבדק בחומר המדלל, והכינו שבעה דילולים סדרתיים כפולים של החיסון שנבדק בדילול כמתואר בטבלה השנייה של פרוטוקול הטקסט. חלקו 200 מיקרוליטר מכל דילול חיסון שנבדק בשכפול לכל באר של המיקרופלייט. מכסים את המיקרופלייט בניילון דבק, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן, הסר את הסרט, שאב בזהירות והעביר את תכולת כל באר לנמען המכיל תמיסת נתרן היפוכלוריט של 2.7%. כדי לשטוף את הצלחת, הוסף 300 מיקרוליטר מאגר כביסה לכל באר. שאפו בזהירות, והעבירו את תכולת כל באר לנמען המכיל תמיסת נתרן היפוכלוריט 2.6%.

חזור על תהליך הכביסה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את האנטיגן הלא קשור. ושמור על טרימרים של חלבון G הקשורים לנוגדנים המצופה. הפוך את המיקרופלטה השטופה ותן לה להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר מכן, יש להפיץ 200 מיקרוליטר מהדילול המומלץ של נוגדן חד שבטי D1 המסומן בפרוקסידאז בדילול לכל באר.

מכסים את המיקרופלייט בניילון דבק, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, הסר את הסרט, שאב בזהירות והעביר את תכולת כל באר לנמען המכיל תמיסת נתרן היפוכלוריט 2.6%. כדי לשטוף את המיקרופלייט, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר.

שאפו בזהירות, והעבירו את תכולת כל באר לנמען המכיל תמיסת נתרן היפוכלוריט 2.6%. חזור על תהליך שטיפה זה חמש פעמים נוספות כדי להסיר את הנוגדן הלא קשור המסומן בפרוקסידאז. הפוך את צלחת הכביסה ותן לה להתייבש על פיסת נייר סופג בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הפיצו 200 מיקרוליטר של תמיסת כרומין מצע לכל באר. אוטמים את המיקרופלטה בסרט, ודוגרים בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.

בזהירות, נגב את החלק התחתון של המיקרובלייד, והנח אותו בספקטרופוטומטר. קבע את הצפיפות האופטית ב-492 ננומטר עבור כל הבארות המשמשות. אסוף נתונים אלה בקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח. לאחר מכן, צור עלילות הן עבור עקומת החיסון הייחוס והן עבור ערכי הצפיפות האופטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.