בדיקה חיסונית מבוססת חרוזים לכימות מטרות ציטוקינים מרובות

קח צלחת רב-באר עם פילטרים בבסיס.

הוסף דגימת בדיקה המכילה ציטוקינים שונים.

הוסף קבוצות שונות של מיקרוספירות המובחנות על ידי גודל ועוצמת הקרינה הפנימית.

כל קבוצה מצומדת לנוגדנים המכוונים לציטוקין ספציפי.

דגרו את הצלחת בחושך תחת תסיסה.

הנוגדנים נקשרים לציטוקיני המטרה שלהם, ומשתקים אותם על המיקרוספרות.

החל ואקום כדי להסיר את הציטוקינים הלא קשורים. ציטוקינים הקשורים למיקרוספרה נשמרים בשל גודל הנקבוביות הקטן יותר של הממברנה.

הוסף קוקטייל של נוגדנים לזיהוי מצומדים לביוטין הנקשרים לציטוקינים הקשורים למיקרוספרה.

הוסף סטרפטווידין מצומד פלואורסצנטי ודגירה בחושך תחת תסיסה. סטרפטווידין נקשר לביוטין, ומשתק את המדווח על קומפלקס המיקרוספרה.

הסר מולקולות לא קשורות והשהה מחדש את המיקרוספרות.

באמצעות ציטומטריית זרימה, זהה את הציטוקינים הקשורים על ידי קביעת הגודל והפלואורסצנטיות הפנימית של המיקרוספרות.

כדי לקבוע את הכמות של ציטוקין ספציפי, מדוד את עוצמת הקרינה של המדווח.

כדי לבצע את הבדיקה, אפשר לכל הריאגנטים להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

לוחות סינון פוליפרופילן משמשים בהדגמה זו. חיוני לחלוטין שהצלחת תישמר זקופה במהלך כל הליך הבדיקה, כולל שלבי הכביסה, כדי למנוע אובדן החרוזים.

הרטיבו מראש את נייר הסינון על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x לכל באר, ותנו לצלחת לשבת דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את נפח המאגר באמצעות סעפת הוואקום. כתם את מאגר הכביסה העודף מתחתית הצלחת על ידי לחיצה על הצלחת על ערימת מגבות נייר נקיות. לאחר מכן הניחו את הצלחת על גבי מכסה הצלחת ההפוך.

עבור דגימות סופרנטנט של תרבית תאים, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל הבארות. הוסף 25 מיקרוליטר מכל תקן לבארות הסטנדרטיות. לבסוף, הוסף 25 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות הדגימה. מערבולת את החרוזים המעורבים למשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיקרוליטר מהחרוזים המעורבים לכל באר, ונערו את בקבוק החרוזים לסירוגין כדי למנוע שקיעת חרוזים.

אוטמים את הצלחת בעזרת אוטם צלחות. לאחר האיטום, עטפו את כל הצלחת, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, בנייר אלומיניום. מניחים את הצלחת על שייקר צלחת, מהדקים אותה ומנערים בחום של כ-500 סל"ד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. מבלי להפוך, הנח את הצלחת על סעפת הוואקום והחל את הוואקום כמו קודם. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x לכל באר.

הסר את תכולת בארות לוחית הבדיקה על ידי סינון ואקום. כתם את מאגר הכביסה העודף מתחתית הצלחת בעזרת כרית סופגת או מגבות נייר לפני שתחזור על שלב זה פעם נוספת. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של נוגדנים לזיהוי לכל באר. לאחר איטום הצלחת עם אוטם צלחות טרי, עטפו את כל הצלחת, כולל מכסה הצלחת ההפוכה, בנייר אלומיניום.

מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים בחום של כ -500 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר. מבלי לשאוב אבק, הוסף 25 מיקרוליטר של מגיב סטרפטווידין פיקואריתרין ישירות לכל באר. אוטמים ועוטפים את הצלחת כמו קודם. ולאחר מכן. מניחים את הצלחת על שייקר צלחת ומנערים בחום של כ-500 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר חזרה על שלב סינון הוואקום פעמיים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1x לכל באר. השעו מחדש את החרוזים על שייקר צלחת למשך דקה. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, העבירו את הדגימות מלוח המסנן לצינורות FACS על מנת לקרוא את הדגימות על ציטומטר זרימה.