אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 3:39 דק׳ • July 8th, 2025
קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי יונקים עטופים במערכת הידרוג'ל המחקה את סביבת המטריצה החוץ-תאית הטבעית.
הסר את מדיום התרבות. טפל עם מאגר קיבוע כדי להצליב את החלבונים, תוך שמירה על שלמות התא.
הוסף תמיסה המכילה חומר ניקוי כדי לחלחל את קרום התא.
הציגו פתרון חוסם למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים בשלבים הבאים.
הוסף קוקטייל נוגדנים ראשוני שנכנס לתאים ונקשר במיוחד לחוטי ביניים ציטופלזמיים ולגורם שעתוק המטרה.
הסר את הנוגדנים הלא קשורים. הציגו נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית וכתם גרעיני כדי לתייג את ה-DNA באופן פלואורסצנטי.
הסר את המולקולות הלא קשורות.
הרכיב את תרבות ההידרוג'ל על מגלשה באמצעות מדיום הרכבה.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להתבונן בתאים המוכתמים במערכת החיסון.
ראשית, שאפו את המדיום מכל באר. לאחר מכן, שטפו את הבארות עם 1 מיליליטר DPBS חם. לאחר סיום הכביסה, הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר. לאחר מכן, דגרו את צלחת 24 הבארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת הקיבוע מכל אחת מהבארות, ולהשליך את הקיבוע למיכל פסולת מסוכנת. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של DPBS לדגימה והשליך מיד את ה-DPBS למיכל פסולת מסוכנת.
לאחר מכן, הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסת חדירות כדי לחדור את הדגימה למשך שעה בטמפרטורת החדר על הנדנדה, ב -15 סיבובים לדקה. לאחר שעה, שאפו את תמיסת החדירות והוסיפו לדגימה 750 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. השאירו את הדגימה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים הרצויים בתמיסת דילול הנוגדנים.
לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים לכל דגימה. דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית. לאחר מכן, שטפו את הדגימות עם PBST למשך שעה שלוש פעמים, בטמפרטורת החדר, ב -15 סיבובים לדקה.
לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים ו-5 מ"ג/מ"ל של תמיסת מלאי DAPI כדי להשיג ריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר מהתמיסה לכל דגימה. לאחר מכן, השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את צלחת 24 הבארות ולדגור את הצלחת ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את הדגימות עם PBST שלוש פעמים, כל אחת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה. לאחר מכן, מקם טיפה של מדיום הרכבה קשיח על פני מגלשת זכוכית והנח את הדגימה על מדיום ההרכבה. לבסוף, השתמש בלק כדי לאטום את הדגימות לשקופית כיסוי הזכוכית כדי למנוע זיהום או תנועת דגימה.