טכניקת מבחנה לחקר סחר בקולטן גלוטמט בתאי עצב בהיפוקמפוס
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 5:27 דק׳ • July 8th, 2025
קח שלוש דגימות של תרביות עצביות בהיפוקמפוס על כיסויים.
הציגו נוגדנים ראשוניים כדי לסמן את קולטני הגלוטמט המתבטאים על פני השטח.
הוסף מדיום מותנה לדגימה השנייה והשלישית כדי לגרום לאנדוציטוזיס של הקולטנים הקשורים לנוגדנים.
בדגימה השלישית, הוסף שברי Fab כדי לחסום אפיטופים על הנוגדנים הלא אנדוציטוזיים.
הכנס מעכב לחסימת אנדוציטוזיס של קולטנים תוך מתן אפשרות למיחזור קולטנים לפני השטח.
בכל הדגימות, תקן את התאים והוסף פתרון חוסם כדי למנוע תיוג לא ספציפי.
הציגו נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים על הקולטנים הקשורים לפני השטח, כולל אלה הממוחזרים.
לחדור את קרומי התאים.
הוסף שוב את הנוגדן הראשוני לדגימה הראשונה כדי לסמן את הקולטנים האנדוציטוזיים הקיימים.
הציגו נוגדן משני שונה המתויג פלואורופור לכל הדגימות כדי לתייג את הנוגדנים הראשוניים הקשורים לקולטן האנדוציטוזה, תוך הבחנה בין קולטנים אנדוציטוזיים לקולטנים הקשורים לפני השטח.
באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כמת את הקולטנים המתבטאים על פני השטח, האנדוציטוזים והממוחזרים בטיפולים השונים.
כדי להתחיל בהליך זה, העבר את הכיסויים בצד התא כלפי מעלה למגש מכוסה בסרט פרפין כדי לחסוך ריאגנטים ולהקל על המניפולציה. שמור ותחזק מדיה ממוזגת ב-37 מעלות צלזיוס לשלבי הדגירה והכביסה.
דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים במדיה מותנית בטמ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים