הערכת זרימת סידן הנגרמת על ידי קולטן תאי T באמצעות צבע מחוון סידן

התחל עם תרחיף תאי T של עכבר והכנס צבע אינדיקטור סידן - Indo-1-acetoxymethyl ester.

הצבע נכנס לתאים, שם אסטרזות תוך-תאיות מבקעות את קבוצת האצטוקסימתיל ליצירת Indo-1 אטום לממברנה, המציג פלואורסצנטיות מובהקת בצורות נטולות סידן וקשורות לסידן.

הוסף נוגדנים לקולטן Fc כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים.

הציגו נוגדנים עם תווית פלואורופור כדי להכתים תת-קבוצות של תאי T.

הסר נוגדנים לא קשורים והכתים בצבע חי שמכתים תאים חיים ומתים באופן דיפרנציאלי.

בציטומטריית זרימה, זהה תחילה פלואורסצנטיות עמומה של תאים חיים וזהה תאי T מתויגים פלואורופור, ולאחר מכן מדידת פלואורסצנטיות Indo-1 בתוך תאים אלה.

לטפל בנוגדנים נגד CD3, המקיימים אינטראקציה עם קומפלקס קולטן תאי T CD3 ומפעילים מסלולי איתות של תאי T, וגורמים לזרם סידן לציטוזול.

צבע הודו-1 מקיים אינטראקציה עם יוני הסידן המשוחררים, ומעביר את הקרינה של הצבע מכחול לסגול.

השינוי בקרינה של הודו-1 ממצבים נטולי סידן למצבים הקשורים לסידן מאשר את זרם הסידן המושרה על ידי קולטני תאי T.

כדי להתחיל, הכינו תמיסת מלאי של 1 מיקרוגרם למיקרוליטר של Indo-1 AM על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של DMSO לבקבוקון, המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. מדללים את תמיסת המלאי לנפח מתאים של cRPMI בריכוז של 6 מיקרוגרם למיליליטר.

מניחים את המדיום באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש במדיום זה כדי לדלל תרחיף תאים שהוכן בעבר ביחס של 1 ל-1 כדי לקבל 5 עד 6 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, לצלחת תרבית רקמות של 12 בארות, הוסף 1 מיליליטר של תרחיף תאים לבאר, לכל תנאי ניסוי.

הכן דגימת בקרה מוכתמת אחת עבור Indo-1 AM נטול סידן על ידי הוספת EGTA לתאים טעוני צבע Indo-1. תקן באר להדברה שלילית ביולוגית ללא פלואורופורים או צבע אינדו-1. הכן בקרה חיובית Indo-1 על ידי הוספת יונומיצין בריכוז של 50 מיקרומול לתרחיף התאים הטעון בצבע בציטומטר הזרימה.

כמו כן, הכינו באר לבקרות של כתם יחיד עבור אוכלוסיות תאים נוספות, באמצעות פלואורופורים מצומדים לנוגדנים. לאחר מכן הוסיפו 2 מיקרוגרם של נוגדן חוסם קולטן FC למיליון תאים, ודגרו על הצלחת למשך 45 דקות, עם הקשה כל 15 דקות כדי להשהות מחדש את התאים.

לאחר הדגירה יש לערבב ולהוציא את כל נפח התאים מהצלחת ולהוסיף אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה ושפכו את הסופרנטנט. לאחר שטיפת התאים עם 1 מיליליטר של cRPMI מחומם מראש, גלולה שוב ושפכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים ב-1 מיליליטר של cRPMI, ודגרו על כל צינור, והשאירו את החלק העליון של הצינור פתוח מעט להחלפת גזים, מה שמאפשר דה-אסטריפיקציה מוחלטת של אסטרי ה-AM התוך-תאיים. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר של כל הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום המוגדרים על ידי המשתמש, והוסיפו אותה לתאי המנוחה עבור מיליליטר אחד מנפח התא.

לאחר מנוחה, גלו את התאים ושטפו את הגלולה על ידי השעיה מחדש ב-1 מיליליטר של cRPMI מקורר ל-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה והניח את הצינורות על קרח. השעו מחדש דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI נטול פנול אדום, באמצעות צינור זרימת פוליסטירן בנפח 5 מיליליטר עם מכסה.

כדי לשמור על הטמפרטורה באמצעות ניתוח שטף סידן, הכינו אמבט חרוזים על ידי הוספת חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן, וחממו אותו עד 37 מעלות צלזיוס. חותכים בזהירות צינור חרוטי של 50 מיליליטר לשניים, וזורקים את החלק העליון של הצינור. מלאו 3/4 מהצינור שנותר בחרוזי אמבטיה, והניחו לו להגיע ל -37 מעלות צלזיוס באמבט החרוזים.

הנח את אמבט החרוזים ליד ציטומטר זרימה, יחד עם מתלה קלקר למיקום הצינור. לפני הניתוח על ציטומטר הזרימה, יש לחמם את הצינורות בנפרד ל -37 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. היכנס לתוכנת ציטומטר הזרימה ולחץ על הכרטיסייה ספרייה.

לאחר מכן, בחר תגיות פלואורסצנטיות כדי להוסיף Indo-1 קשור לסידן ו-Indo-1 נטול סידן. לאחר מכן, בחר לייזר UV תחת קבוצות תגים פלואורסצנטיות, ולחץ על הוסף הוסף כדי להוסיף שם תג פלורסנט. בחר את עירור הלייזר ואת אורך גל הפליטה ולאחר מכן לחץ על שמור.

המשך להגדרת הניסוי. לחץ על לשונית רכישה. פתח או צור ניסוי חדש, והוסף את תגי הפלואורסצנט הרצויים לניסוי. צור קבוצת התייחסות וקבוצת דגימה חדשה עבור הניסוי, ותייג את שתי הקבוצות.

תחת הכרטיסייה רכישות, הגדר את האירועים לתיעוד למקסימום של 10 מיליון, עצירת עוצמת הקול לנפח המרבי של 3,000 מיקרוליטר וזמן עצירה למקסימום של 36,000 שניות. רכוש בקרות מוכתמות בודדות עבור נוגדנים מצומדים המוגדרים על ידי המשתמש, הכלולים בפאנל הרב-צבעוני, ועבור צבע פונקציונלי Indo-1.

הוסף 50 מיקרומול של יונומיצין לבקרה ולמערבולת החיובית של הודו-1 הקשורה לסידן. הוסף את צינור הזרימה ללוח הזרקת הדגימה ולחץ על הקלט. לאחר מכן, הוסף בקרה שלילית Indo-1 נטולת סידן לציטומטר הזרימה ולחץ על הקלט.

בטל את הערבוב של הפקדים המוכתמים על ידי לחיצה על כפתור Unmix. לאחר השלמת הערבוב, צור עלילות עוקבות באמצעות גליון העבודה הלא מעורב, כגון SSCA לעומת FSCA להסרת פסולת מהדגימה, ו-SSCA לעומת SSCH להסרת כפילויות.

לאחר מכן צור שערים על ידי לחיצה על עלילה. הוסף עלילה לגליון העבודה ולחץ פעמיים בתוך השער כדי ליצור אוכלוסייה מגודרת במורד הזרם. המשך עד שכל האוכלוסיות המעניינות יילקחו בחשבון. לאחר מכן, יש לחמם את דגימות הבקרה שהוכנו קודם לכן ל-37 מעלות צלזיוס לניתוח רציף.

הגדר את תוכנת ציטומטריית הזרימה, והפעל מים נטולי יונים למשך 2 עד 3 דקות כדי להבטיח את היציבות הנוזלית של ציטומטר הזרימה. הגדר תרשימים רציפים בגליון העבודה הלא מעורב על-ידי יצירת שערים באמצעות לחצני המצולע, המלבן או שער האליפסה כדי לכלול את אוכלוסיית העניין.

לחץ פעמיים בתוך השער ושנה את הפרמטרים של ציר ה-y וה-x ל-SSCA לעומת SSCH. השלם את הגדרת פרמטרי הציר על ידי לחיצה שמאלית על הציר. צור עלילה עם SSCA לעומת אות צבע כדאיות. שער את התאים החיים, שהם צביעת צבע שלילית או אמין.

תאים חיים שליליים לצביעה של מת חי יתקבצו בסימן האפס הן בציר ה-y והן בציר ה-x. לחץ פעמיים על התרשים הפנימי כדי ליצור תרשים חדש, המכיל רק לימפוציטים חיים חד-תאיים. שנה את ציר ה-y ל-1 לעומת זמן על ציר ה-x להמחשה חזותית של זרם הסידן.

לאחר מכן, הנח את הדגימה הביולוגית המחוממת לתוך ה-SIT של המכונה. הפעל את הדגימות במהירות של 2,500 עד 3,000 אירועים בשנייה בקצב זרימה בינוני כדי לדמיין את זרימת הסידן במספר מוגבל של אוכלוסיות תאים. הוסף את הצינור הבא לאמבט החרוזים.

בבקרת רכישה, לחץ על הקלט כדי להקליט את הנתונים הראשוניים למשך 30 שניות כדי לקבל רמה בסיסית של איתות סידן בדגימה. לאחר מכן לחץ על עצור, והסר את הצינור מיציאת הזרקת הדגימה. הוסף 30 מיקרוגרם של אנטי-CD3 לא מצומד ישירות לתוך צינור הדגימה כדי ליזום זרימת סידן.

הנח במהירות את הצינור בחזרה על יציאת הזרקת הדגימה, ולחץ על הקלט בתוכנה. הקלט נתונים במשך שבע דקות, תוך צפייה בזמן שחלף תחת בקרות הרכישה בתוכנה. לאחר מכן לחץ על עצור בתוכנה.