הערכת זרימת סידן הנגרמת על ידי קולטן תאי T באמצעות צבע מחוון סידן

התחל עם תרחיף תאי T של עכבר והכנס צבע אינדיקטור סידן - Indo-1-acetoxymethyl ester.

הצבע נכנס לתאים, שם אסטרזות תוך-תאיות מבקעות את קבוצת האצטוקסימתיל ליצירת Indo-1 אטום לממברנה, המציג פלואורסצנטיות מובהקת בצורות נטולות סידן וקשורות לסידן.

הוסף נוגדנים לקולטן Fc כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים.

הציגו נוגדנים עם תווית פלואורופור כדי להכתים תת-קבוצות של תאי T.

הסר נוגדנים לא קשורים והכתים בצבע חי שמכתים תאים חיים ומתים באופן דיפרנציאלי.

בציטומטריית זרימה, זהה תחילה פלואורסצנטיות עמומה של תאים חיים וזהה תאי T מתויגים פלואורופור, ולאחר מכן מדידת פלואורסצנטיות Indo-1 בתוך תאים אלה.

לטפל בנוגדנים נגד CD3, המקיימים אינטראקציה עם קומפלקס קולטן תאי T CD3 ומפעילים מסלולי איתות של תאי T, וגורמים לזרם סידן לציטוזול.

צבע הודו-1 מקיים אינטראקציה עם יוני הסידן המשוחררים, ומעביר את הקרינה של הצבע מכחול לסגול.

השינוי בקרינה של הודו-1 ממצבים נטולי סידן למצבים הקשורים לסידן מאשר את זרם הסידן המושרה על ידי קולטני תאי T.

כדי להתחיל, הכינו תמיסת מלאי של 1 מיקרוגרם למיקרוליטר של Indo-1 AM על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של DMSO לבקבוקון, המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. מדללים את תמיסת המלאי לנפח מתאים של cRPMI בריכוז של 6 מיקרוגרם למיליליטר.

מניחים את המדיום באמבט מים בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הש