JoVE Encyclopedia of Experiments
אימונולוגיה
0 צפיות • 4:24 דק' • July 8th, 2025
קח צינור המכיל תרחיף של חיידקי מעיים אנושיים.
הוסף חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי, או VLPs. ה-VLPs מכילים קפסיד ויראלי שלם אך חסר RNA גנומי, מה שהופך אותם ללא מדבקים לבני אדם.
במהלך הדגירה, חלבוני הקפסיד VLP נקשרים לפחמימות ספציפיות המתבטאות על פני השטח של החיידקים, ויוצרים קומפלקסים של חיידקי VLP.
צנטריפוגה כדי לגלול את הקומפלקסים ולהשליך את ה-VLPs הלא קשורים.
הציגו תמיסת חסימה המכילה חלבון כדי לחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים, ולהפחית את צביעת הרקע בשלבים הבאים.
הוסף נוגדנים ספציפיים ל-VLP עם תווית פלואורסצנטית ודגירה.
הנוגדנים נקשרים לאתרי המטרה שלהם בקפסיד ה-VLP, ומסמנים את קומפלקסי חיידקי ה-VLP.
צנטריפוגה לגלולה את המתחמים. השליכו נוגדנים לא קשורים והשעו מחדש את הגלולה במאגר זרימה ציטומטרית.
באמצעות ציטומטר זרימה, זהה אותות פלואורסצנטיים הנפלטים על ידי קומפלקסים של חיידקי VLP, המאפשרים לכמת את אחוז החיידקים הקשורים בדגימה.
לאחר הכנת הריאגנטים, הנוגדנים והחיידקים כמתואר בכתב היד, הרכיבו את כל החומרים בארון בטיחות ביולוגית BSL II.
חלקיקים דמויי וירוס לנורו-וירוס אנושי רשומים כפתוגנים BSL II, וכל העבודה המבוצעת באמצעות VLPs צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגית מוסמך.
הוסף 10 מיקרוגרם של VLPs נורו-וירוס אנושי לכל צינור של חיידקים, וערבב היטב על ידי פיפטינג. דגרו את הצינורות למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב מתמיד. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות ב -10,000 פעמים גרם למשך 5 דקות.
שאפו והשליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור החיידק במיליליטר אחד של PBS. לאחר חזרה על שלבי הכביסה פעם אחת, צנטריפוגה את הצינורות שוב ב -10,000 פעמים גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור חיידקי ה-VLP ב-150 מיקרוליטר של מאגר חוסם של 5%.
שגיאה נפוצה המתרחשת היא החלפת צינורות והוספת טיפול שגוי. כדי למנוע זאת, סדרו את כל הצינורות בקווים המתאימים לטיפול הנכון, והוסיפו טיפול אחד בבת אחת לצינורות.
עבור כל דגימת חיידקים, הכינו 50 מיקרוליטר של נוגדן נורו-וירוס אנושי מדולל G2. באמצעות מאגר חוסם של 5%, יש לדלל את הנוגדן 1 עד 125 עבור דגימות מקרה של E. coli. הכן 50 מיקרוליטר של נוגדן איזוטיפי מדולל לכל דגימת חיידקים תוך שימוש באותם יחסי דילול. חלקו כל דגימת בדיקת חיבור ל-350 מיקרוליטר על ידי העברתם לצינורות צנטריפוגה נקיים של 1.5 מיליליטר.
כדי ליצור בקרות לא מוכתמות, הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר חוסם למנה הראשונה מכל דגימת חיידקים. עבור הדגימות המוכתמות, הוסף 50 מיקרוליטר של דילול נוגדנים G2 לסט השני של האליקוטים. צור את בקרות האיזוטיפ על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של נוגדן האיזוטיפ המדולל לקבוצה השלישית של האליקוטים.
דגרו את כל הדגימות על קרח ובחושך למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את כל הדגימות ב-10,000 פעמים גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנטים והשעו מחדש כל דגימה ב-150 מיקרוליטר של FCSB. שוב, צנטריפוגה את כל הדגימות ב-10,000 פעמים גרם למשך 5 דקות. שוב, השליכו את הסופרנטנטים והשעו מחדש את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של FCSB.
לאחר צנטריפוגה של הדגימות בפעם האחרונה והשלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הדגימות ב-150 מיקרוליטר של FCSB. העבירו כל דגימה לצינור המכיל 400 מיקרוליטר FCSB לנפח כולל של 550 מיקרוליטר. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהן מנותחות על ידי ציטומטריית זרימה.