בדיקת In Vivo לזיהוי מיטופגיה בנמטודות טרנסגניות

קחו לדוגמה נמטודות טרנסגניות, עם תאי שריר בדופן הגוף המבטאים DCT-1 ירוק מתויג פלואורופור, חלבון ממברנה מיטוכונדריאלית חיצונית, ו-LGG-1 מתויג פלואורופור אדום, חלבון ממברנת פגופור.

הניחו את התולעים על גבי מצע גידול המכיל תרופה הגורמת למיטופגיה.

התרופה פוגעת במיטוכונדריה התאית, ויוזמת מיטוכונדריה או פינוי סלקטיבי של מיטוכונדריה פגומה.

DCT-1 על מיטוכונדריה פגומה עובר אוביקוויטינציה וזרחון, מה שמקל על אינטראקציה עם LGG-1 על קרום הפגופור.

הפגופור מתרחב סביב המיטוכונדריה ויוצר אוטופאגוזום המיועד לפירוק ליזוזומלי.

הניחו את הנמטודות בחומר הרדמה על שקופית מיקרוסקופ כדי לשתק אותן, והניחו כיסוי.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין כתמים צהובים בתוך תאי השריר, מה שמצביע על מיקום משותף של DCT-1 הפולט פלואורסצנטיות ירוקה ו-LGG-1 המציג פלואורסצנטיות אדומה. זה מאשר את התרחשות המיטופגיה.

ביום הראשון, בחרו זחלי L4 של בעלי חיים טרנסגניים המבטאים גם DCT-1::GFP וגם DsRed::LGG-1 בתאי שריר דופן הגוף והניחו אותם על צלחת מדיה לגידול נמטודות עם זרעי OP50. מניחים 5 עד 10 תולעים על כל צלחת של 3.5 סנטימטר באמצעות שלוש צלחות לפחות. בסיום, דגרו על הנמטודות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, ביום החמישי, סנכרנו את הנמטודות על ידי בחירת 15 עד 20 זחלים טרנסגניים L4 והעברתם לצלחות זרעי OP50 טריות. השתמש לפחות ב-5 צ