אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
אימונולוגיה
0 צפיות • 7:32 דק׳ • July 8th, 2025
כדי לזהות סמן ביולוגי חלבוני הקשור למחלה, קח צלחת בדיקה חיסונית.
הצלחת מכילה מטריצות הפרדה וערימה מלאות מראש הנדרשות להפרדת חלבון מבוססת גודל.
טען את החלבונים ואת ריאגנטים לבדיקה חיסונית לבארות צלחת נפרדות.
התחל את הריצה בתוך מנתח CEI. המחסנית הנימים במנתח שואבת את המטריצות ליצירת ג'ל בתוך כל נימי.
לאחר מכן הנימים שואבים את החלבונים. במהלך האלקטרופורזה, החלבונים נודדים ונפרדים על סמך המשקל המולקולרי שלהם.
המנתח מכניס אור UV, ומשתק את החלבונים בנימים.
מאגר הכביסה מסיר את המטריצות והחלבונים הלא קשורים. לאחר מכן המאגר החוסם זורם פנימה, וחוסם אתרי אינטראקציה לא ספציפיים.
המנתח מציג נוגדנים ראשוניים הנקשרים לסמן הביולוגי, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז המקיימים אינטראקציה עם הנוגדנים הראשוניים.
שוטפים ואז מוסיפים את המצע הכימילומינסנציה. פרוקסידאז מחמצן את המצע ופולט זוהר.
מדוד את עוצמת הזוהר והשווה אותה לתקן החלבון לזיהוי סמנים ביולוגיים.
לאחר איסוף 100 מיקרוליטר של ליזאטים של טסיות דם אנושיות מחולי ALS ונבדקים בריאים, מלא תבניות שנוצרו בתוך הבית עבור פריסת הנימים והכנת הדגימה. טבלת הכנת תערובת הדגימה היא דינמית ותחשב אוטומטית כמה נפח יש להסיר מהמקור. הנח את כל ריאגנטים לבדיקה על קרח, למעט החבילה הסטנדרטית שאמורה להישאר בטמפרטורת החדר.
כדי להכין את תערובת המאסטר הפלואורסצנטית, הוסף 40 מיקרוליטר של מים נטולי יונים לצינור שקוף של DTT, והוסף 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 10, ו-20 מיקרוליטר מתמיסת ה-DTT המוכנה של 400 מילי-מולרית לצינור הוורוד מערכת הבדיקה.
להכנת הסולם הביוטינילי, הוסף 16 מיקרוליטר של מים נטולי יונים, 2 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 10 ו-2 מיקרוליטר מתמיסת ה-DTT המוכנה של 400 מילי-מולרית לצינור הלבן המסופק בערכה. לאחר ערבוב עדין, העבירו את תמיסת הסולם לצינור PCR של 200 מיקרוליטר לפני הדנטורציה.
הוסף 1.5 מיקרוליטר של מאגר דגימה 10X ו-148.5 מיקרוליטר מים נטולי יונים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 600 מיקרוליטר. ומערבולת לערבב, לפני הנחת הצינור על קרח. הוסף את הנוגדנים המעניינים ישירות לדילול, כפי שמצוין בטבלה, ושטוף את קצה הפיפטה מספר פעמים כדי לקבל תמיסת נוגדנים הומוגנית.
כדי להכין את תערובת הדגימה הנימים, פתח את כל צינורות ה-PCR, והוסף 1.6 מיקרוליטר של מאגר דגימה פלואורסצנטי 5X לכל צינור, כפי שמצוין בטבלה, בטכניקת פיפטינג הפוכה, וסגור מיד כל צינור עם הוספת המאגר. לאחר הוספת כל המאגר, פתח את כל הצינורות והוסף מאגר דגימה של 0.1x בנפחים כפי שמצוין בטבלה, וסגור מיד כל צינור עם הוספת המאגר.
לאחר מכן, פתח את כל הצינורות, והוסף את דגימות החלבון כפי שמצוין בטבלה, וסגור מיד כל מכסה צינור. לאחר הוספת כל הדגימות, צנטריפוגה קצרה את כל הצינורות בצנטריפוגה על שולחן. מערבולת לערבב, וצנטריפוגה שוב את הדגימות.
בתום הצנטריפוגה השנייה, הכניסו את כל הצינורות לתרמו-סייקלר עם מכסה מחומם, ודנטורציה של הדגימות בתנאים שצוינו. בסוף הדנטורציה, צנטריפוגה, מערבבים וצנטריפוגה שוב את הדגימות, ומניחים את כל הצינורות במתלה צינורות על קרח.
בעזרת האיור כמדריך, הוסף 10 מיקרוליטר של סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז לבאר D1, 10 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המתאים לבארות D2 עד D5, 10 מיקרוליטר של נוגדנים מדללים לכל באר בשורה B ולבאר C1, 10 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני המתאים לבארות C2 עד C25, 5 מיקרוליטר של סולם ביוטיניל מצינור PCR מספר 1 לבאר A1, 3 מיקרוליטר של דגימה לשורות A2 עד A25, ו-15 מיקרוליטר של מי חמצן לומינול טריים לכל באר בשורה E.
הזרמת תערובת הדגימה והריאגנטים לבאר הזעירה בסדר הנכון היא קריטית להצלחת הניסוי, ולכן יש לעשות זאת בזהירות רבה.
לאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל מאגר כביסה ייעודי, וסובב את תכולת הצלחת על ידי צנטריפוגה.