הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובת משתתפים לניתוח תת-אוכלוסיות תאי T עמידים לאימונותרפיה

קח קריוסקציה של רקמת קרצינומה של תאי כליה המציגה תאי CD8+ T חודרים במיקרו-סביבת הגידול שלה.

טפל בזה באצטון כדי לתקן ולחלחל את הרקמה. שוטפים כדי להסיר עודפי אצטון.

הוסף אבידין כדי להרוות ביוטין של רקמות אנדוגניות. לאחר מכן, הוסיפו ביוטין כדי לחסום אתרי קשירת אבידין משותקים, ולמזער אינטראקציות לא ספציפיות.

יש למרוח סרום המכיל אימונוגלובולינים כדי לחסום קולטני Fc של תאי חיסון, ולמנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף קוקטייל נוגדנים ראשוני המכוון ל-CD8, סמן תאי T ציטוטוקסי, ו-PD-1 ו-Tim-3, קולטנים מעכבים המתבטאים על ידי תת-אוכלוסיות תאי CD8+ T עמידות לאימונותרפיה.

להציג נוגדנים משניים מובהקים המסומנים בפלואורופור המכוונים לנוגדנים נגד CD8 ואנטי-Tim-3.

הוסף נוגדנים משניים ביוטיניליים המכוונים לנוגדנים נגד PD-1 וסטרפטווידין אחר המסומן על ידי פלואורופור המקשר לביוטין.

מרחו מדיום הרכבה המכיל צבע על גרעיני התאים מכתימים והניחו כיסוי.

רכוש תמונות פלואורסצנטיות מולטי-ספקטרליות כדי לזהות את תאי ה-CD8+ T החודרים לגידול ואת תת-האוכלוסיות העמידות לאימונותרפיה המבטאות PD-1, Tim-3 או שניהם.

לאחר ההפשרה, השתמש במגבת נייר כדי לייבש בזהירות את השקופיות סביב חלקי הרקמה, והקיף את הרקמות בעט מחסום הידרופובי. כאשר המחסום התייבש, תקן את הדגימות ב-100% אצטון למשך 5 דקות, ולאחר מכן 2 דקות של ייבוש באוויר. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-TBS למשך 10 דקות.

טפל בשקופיות עם שלוש טיפות של 0.1% אבידין למשך 10 דקות בחושך. לאחר מכן, הקש או החלק את השקופיות כדי לכסות את הטישו בתמיסת אבידין. הוסיפו שלוש טיפות של 0.01% ביוטין לכל דגימה, והקישו או העבירו את הביוטין על פני הדגימות, ולאחר מכן שטיפה של TBS, כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, חסום כל קשירה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטר של 5% סרום רגיל ב-TBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, הקש על השקופיות כדי להסיר את עודפי הסרום, ודגר את השקופיות ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים העיקרי המעניין למשך שעה אחת בתא לח. שטפו את השקופיות עם תווית הנוגדנים ב-TBST למשך 5 דקות.

לאחר הייבוש, סמנו את התאים עם 100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המשני המעניין למשך 30 דקות בתא הלח, ולאחר מכן שטיפה של 10 דקות ב-TBS. דגרו את השקופיות המיובשות עם הנוגדנים המשניים עם 100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים השלישוני המעניין למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה אחרונה של 10 דקות TBS.

בתום הכביסה, יבשו את השקופיות והרכיבו את הרקמות עם אמצעי ההרכבה בתוספת DAPI. לאחר מכן, כסו כל שקופית בהחלקת כיסוי, ותנו למדיום ההרכבה להתייצב למשך שעתיים לפחות.

כדי לסרוק את השקופיות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ וטען את פרוטוקול סריקת התמונות. טען את השקופית הראשונה על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן, בסרגל הבקרה, לחץ על הגדר חשיפה והתאם את זמן החשיפה עבור כל מסנן עד לקבלת אות מספיק אך לא רווי.

לחץ על התחל בחלונית העליונה ופתח את תיקיית מזהה המעבדה. הזן את המזהה של השקופית הראשונה ולחץ על הבא.

כדי לקבל את הסקירה הכללית של השקופית תחת אור שדה בהיר בהגדלה פי 4, לחץ על הדמיה בשחור-לבן וחפש דגימה. כדי לבחור את אזור הרקמה לסריקה, לחץ על מקש Control והשתמש בסמן כדי לבחור או לבטל את הבחירה באזורי העניין שיש לסרוק בהגדלה פי 4.

לקבלת תמונה פלואורסצנטית אדומה-כחולה-ירוקה של כל אזור, לחץ על הדמיה בהספק נמוך. לבחירת שדה בעוצמה גבוהה, הקש על מקש Control ובחר לפחות חמישה אזורי עניין התואמים לאזורי הרקמה שייסרקו בהגדלה של פי 20.

לאחר מכן, כדי לקבל רכישת תמונה רב-ספקטרלית של כל שדה, לחץ על הדמיה בעוצמה גבוהה ולחץ על אחסון נתונים כדי לאחסן את התמונות בתיקיית מזהה המעבדה המתאימה.