טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

התחל עם שקופית המכילה תאי מארח דבוקים.

הוסף וירוסים ואפשר להם להיכנס לתאי המארח.

הסר את המדיום המושקע. הוסף מדיום טרי כדי לאפשר סינתזה והובלה של חלבון נגיפי.

השתמש בפרפורמלדהיד כדי לשמר את המורפולוגיה של התא ואת מיקום החלבון.

הוסף מולקולות דטרגנט כדי להפוך את התאים לחדירים.

החל מאגר חוסם כדי לחסום אתרי איגוד שאינם יעד.

הוסף נוגדנים ראשוניים הנקשרים לחלבונים נגיפיים מטרה. הסר נוגדנים לא קשורים.

שכבת נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור אדום לתיוג פלואורסצנטי של החלבונים הנגיפיים. הסר נוגדנים לא קשורים.

הוסף מדיום הרכבה פלואורסצנטי המכיל צבע גרעיני כדי להכתים את הגרעינים.

באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, התבונן במיקומם של חלבונים נגיפיים אדומים-פלואורסצנטיים וגרעיני מארח כחולים-פלואורסצנטיים.

אות אדום חזק יותר סביב האזור הכחול מצביע על לוקליזציה ציטופלזמית, בעוד שאות חזק יותר מבפנים מרמז על לוקליזציה גרעינית.

רמות אות שוות באזור הכחול ובסביבתו מצביעות על כך שחלבונים ממוקמים גם בגרעין וגם בציטופלזמה.

20 עד 24 שעות לפני ההדבקה בנגיף, זרעו 5 x 10⁴ תאי פיברובלסטים עובריים אנושיים או HEL לכל באר על מגלשה מדורגת של 4 בארות 11 מילימטר במצע הגידול לדגירה לילית ב-37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני.

חשוב לנענע את המגלשה ביסודיות כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים תוך הקפדה על מניעת שפיכת מדיום התרבית. למחרת, החלף את הסופרנטנטים של תרביות ה-70% עד 80% ב-Medium-199 המכיל 4-10 יחידות יוצרות פלאק לתא, והנח את השקופית ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שעה.

בתום הדגירה, החליפו את הסופרנטנטים במצע גידול טרי, והחזירו את התאים לחממה לתקופת ההדבקה הניסיונית המתאימה. לצביעה אימונופלואורסצנטית של התאים הנגועים בנגיף, שטפו במהירות את התאים שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגירה של 8 עד 10 דקות ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS לבאר. בתום הקיבוע יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS לשטיפה ולחלחל את התאים עם 100 מיקרוליטר של 0.2% פעילי שטח לא יוניים לבאר למשך 5 עד 10 דקות.

שטפו את התאים החדירים שלוש פעמים ב-PBS כפי שהודגם, והוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף את הריכוז המתאים של הנוגדן העיקרי המעניין לכל באר לדגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, הסר כל נוגדן ראשוני לא קשור בשלוש שטיפות של 10 דקות במאגר חוסם טרי, והוסף נוגדן משני מתאים לכל באר לדגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.

בתום הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים במאגר חוסם כפי שהודגם, ולאחר מכן שטיפה אחת ב-PBS, והוסיפו טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דהייה, בתוספת DAPI לכל באר. לאחר מכן הניחו כיסוי מעל המגלשה, ואטמו את הכיסוי עם לק שקוף.

הפעלת לחץ עדין בזמן הרכבת החלקת הכיסוי תסיר כל אמצעי הרכבה עודף, ותסייע להבטיח רכישת תמונות באיכות גבוהה.

כדי לנתח את ההתפלגות הגרעינית והציטופלזמית של ICP0, פתח את הפרויקט בתוכנת היישום הקונפוקלי ובחר תמונה. פתח את הכרטיסייה כמות ובחר מיין אזורי עניין מתפריט כלים. בחר צייר קו וצייר קו אורך לאורך התא לניתוח. תופיע היסטוגרמה המציגה את עוצמת הקרינה לאורך הקו הן עבור החלבון המעניין והן עבור DAPI.

בהתבסס על צביעת הרקע, הגדר סף קבוע לעוצמת החלבון המעניין לניתוח ההתפלגות התת-תאית של החלבון בכל ניסוי. אם אות החלבון, בממוצע, נמצא מתחת לסף באזור הגרעין, אך הוא מעל הסף מעבר לגבול ה-DAPI, סווג את אות החלבון כממוקם בעיקר בתוך הציטופלזמה.

אם אות החלבון נמצא מעל הסף בכל הגרעין ומעבר לגבול אות ה-DAPI, קבץ את אות החלבון כגרעין בתוספת לוקליזציה ציטופלזמית. אם אות החלבון נמצא מעל הסף בגרעין, אך בממוצע הוא מתחת לסף מחוץ לגבול אות ה-DAPI, קבץ את אות החלבון כלוקליזציה גרעינית.