בידוד ועיכול של חלבוני נויטרופילים

התחל עם צינור המכיל נויטרופילים. הוסף חוצץ המכיל מעכב חלבון כדי למנוע פירוק חלבון.

הוסף חומר ניקוי מתאים כדי לחלחל את קרום הנויטרופילים

באמבטיית קרח, סוניקציה של הדגימה עם גלי קול בתדר גבוה כדי לשבש את קרום התא, ולשחרר תוכן תוך תאי, כולל חלבונים שונים.

צנטריפוגה קצרה לאיסוף תכולה מדפנות הצינור והעברתם לצינור מתאים.

הכניסו חומר מפחית ודגרו בטמפרטורה גבוהה כדי לקדם פיצול קשר דיסולפיד, מה שגורם לחלבונים להתפרק.

מצננים ומכניסים ריאגנט אלקילטי האלקילטים של קבוצות הסולפידריל.

הוסף אצטון קר כדי לגרום למשקעי חלבון.

צנטריפוגה לכדור החלבונים ושברי התאים. הסר את הסופרנטנט וייבש באוויר.

הציגו חיץ המכיל חומר דנטורציה וסוניקט כדי להמיס מחדש את גלולת החלבון.

לבסוף, הוסיפו תערובת פרוטאז שמבקעת חלבונים. אחסן את הדגימה להמשך עיבוד.

כדי להתחיל, אסוף את תאי HL60 המובחנים בנויטרופילים בצינור של 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה של הדגימות ב-400 פעמים גרם למשך 5 דקות.

שטפו את גלולת התא פעמיים על ידי הוספת 15 מיליליטר PBS וצנטריפוגה שוב ב -400 פעמים גרם למשך 5 דקות.

הוסף 300 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי Tris HCl pH 8.5 קר כקרח המכיל טבלית קוקטייל מעכב פרוטאינאז לכל דגימה, ומערבל אותם לזמן קצר.

לאחר מכן, הוסף נפח של 1 על 10 של 20 אחוז SDS לריכוז סופי של 2 אחוז ובדוק את הדגימות באמבט קרח למשך 30 שניות הפעלה ו-30