הליך STAGE TIP להתפלה וטיהור של פפטידים

קח STop And Go Extraction או STAGE Tip, עמודת טיהור ממוזערת.

הקצה מכיל חרוזי סיליקה קטנים הקשורים לשרשראות פחמימנים ארוכות לטיהור פפטידים מבוסס אינטראקציה הידרופובית.

שוטפים עם מאגרים המכילים אחוז גבוה של אצטוניטריל, ומסירים זיהומי שרף.

הציגו מאגר מחייב וצנטריפוגה, מאזנים את העמודה לקשירת פפטידים אופטימלית.

טען דגימת פפטיד מעוכלת מראש שהתקבלה מתאים דמויי נויטרופילים מובחנים, המכילים שברי פפטידים וזיהומים, כולל מלחים.

צנטריפוגה כדי להעביר את הדגימה דרך העמודה. שברי הפפטיד נקשרים לשרשראות הפחמימנים באמצעות אינטראקציות הידרופוביות, בעוד שהמלחים מוסרים.

הוסף את מאגר הכריכה והצנטריפוגה, והסר את הזיהומים שנותרו.

הציגו את המאגר הגבוה המכיל אצטוניטריל לפליטה.

בעזרת מזרק, העבירו את המאגר דרך העמודה. אצטוניטריל נקשר לשרשראות הפחמימנים, ומעביר את שברי הפפטיד הנפלטים עם המאגר.

בצע פרופיל פרוטאומי כדי לזהות את הפפטידים המטוהרים.

כדי להתחיל, ארזו שלוש שכבות של שרף C18 בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לבנות קצה STop And Go Extraction או STAGE עבור כל דגימת פפטיד.

עצור את העיכול האנזימטי של דגימות הפפטיד שהודגרו בעבר על ידי הוספת 1 על 10 נפחים של תמיסת עצירה. צנטריפוגה של הדגימות ב-13,200 סל"ד למשך 10 דקות ומעבירה את הסופרנטנט לצינור חדש של 2 מיליליטר.

לאחר מכן, שטפו את קצות ה-STAGE עם 100 מיקרוליטר של 100 אחוז אצטוניטריל וצנטריפוגה את קצות ה-STAGE ב-1000 גרם למשך 2 דקות או עד שכל הנוזל עובר דרך שרף C18.

חזור על שטיפות קצה ה-STAGE עם 50 מיקרוליטר של Buffer B ואחריו 200 מיקרוליטר של Buffer A עם אותם תנאי צנטריפוגה.

טען את הדגימות לתוך קצות STAGE לצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך 3 עד 5 דקות. לאחר מכן, שטפו את קצות ה-STAGE עם 200 מיקרוליטר של Buffer A על ידי צנטריפוגה ב-1000 גרם למשך 3 עד 5 דקות.

לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של Buffer B לכל קצה STAGE, ובעזרת מזרק, הוציא את הדגימות המכילות Buffer B לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר.

לאחר הסרת הדגימות, יבש את הפפטידים באמצעות צנטריפוגת ואקום למשך 45 דקות. הפעל את הדגימות על ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם התנאים המתוארים בכתב היד של הטקסט.

כדי לעבד את הנתונים לפרופיל פרוטאומי, העלה את קבצי הנתונים הגולמיים המתקבלים מספקטרומטריית מסה לתוכנת MaxQuant. עיין בכתב היד של הטקסט עבור כל הפרמטרים של התוכנה והתאמותיה.

בפרמטרים גלובליים, ייבא את קובץ ה-FASTA של הומו ספיינס לזיהוי רצף שהורד ממסד הנתונים של Uniprot המתעד את מזהה האורגניזם, מספר החלבונים ותאריך הורדת הקובץ.

הגדר את מספר ליבות המחשב לעיבוד ובחר התחל. עם השלמת MaxQuant, נוצרת תיקיה 'משולבת', יחד עם קבצים אחרים הדרושים להעלאה למאגרי נתונים.

כדי לנתח את הנתונים, העלה את ה-'proteingroups.txt' ל-Perseus ובחר את כל קבצי הכימות ללא תוויות או קובצי עוצמת LFQ לחלון 'ראשי'. סנן את השורות על-ידי הסרת מזהמים, פפטידים הפוכים ופפטידים המזוהים רק על-ידי אתר ושנה את הנתונים על-ידי log₂(x).

כדי להתבונן במספר החלבונים שזוהו בכל שכפול, בנה דיאגרמת ון מספרית והגדר הערות קטגוריות עבור כל דגימה על ידי מתן שם זהה לכל השכפולים של דגימה ביולוגית אחת.

סנן את השורות על סמך ערך חוקי עם החלבון שזוהה ביותר מ-50 אחוז מהשכפולים ובתוך קבוצה אחת לפחות. כדי להחליף ערכים חסרים עבור LFQ, בצע חישוב מההתפלגות הנורמלית.

הוסף מידע ביאור שהורד מאתר פרסאוס לשורות החלבון על ידי הוספת קבצי FASTA txt.gz בתיקיות 'bin', 'conf' ו-'annotation'. הכניסו מונחים ספציפיים כמו שמות חלבונים, שמות גנים ואונטולוגיה של גנים.

המטריצה הושלמה כעת וניתן להמחיש אותה בכלים כגון עלילות ניתוח רכיבים עיקריים, מפות חום והעשרת קטגוריות. בצע בדיקות סטטיסטיות כדי לקבוע שינויים משמעותיים בשפע החלבון בין התנאים שנבדקו.